软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

软琼脂克隆形成实验

➢ 配制含20%FBS、2X双抗PS的2X1640培养基，用0.2微米的滤器过滤除菌。
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。
THANKS
Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验

克隆形成实验

克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。

平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

单克隆抗体技术：克隆化(有限稀释法、软琼脂克隆化、显微镜操作

单克隆抗体技术：克隆化(有限稀释法、软琼脂克隆化、显微镜操作经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。

克隆的时间一般说来越早越好。

因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。

但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。

克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。

一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

有限稀释法1．材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。

（2）HT培养基2．操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。

并取样进行台盼兰染色，计数。

（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。

（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。

克隆全过程

1.目的基因~~~~~~产物纯化回收将带有目的条带的琼脂糖凝胶，在紫外灯下用已灭菌的刀片,延条带边际仔细切割条带(切割胶块时动作要快，在紫外灯下暴露的DNA易降解，在切胶时尽量一个一个的切，每切一次，关闭紫外灯)。

然后将其放入商品纯化柱内，进行片段纯化。

（具体方法步骤按照AXYGEN纯化试剂盒说明操作）(1)计算凝胶重量，以该重量作为一个凝胶体积，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全融化。

(2)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(3)吸取上述步骤中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min.弃滤液。

(4)将制备管置回2ml离心管，加500ulBuffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。

(5)将制备管置回2ml离心管，加700ulBuffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。

(6)重复（5）。

(7)将制备管置回2ml离心管，12000×g离心1min。

（空离）(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25~30ulEluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。

(9) 跑胶观察是否有纯化结果。

(10) 纯化产物放-20℃保存，备用。

2.扩增片段的克隆纯化的片段连接到克隆载体pMD19-T vector，转化导入宿主菌大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选，获得含所需要的目的片段的质粒。

2.1 扩增片段3’端加“A”尾（此步骤一般不用）反应体系：10×Buffer 1μlMgCl2 (25mM) 1μldATP (10mM) 1μl纯化的PCR产物5μlTaq酶(5U/μL) 1μlddH2O 补齐10μl混匀，瞬间离心，收集到管底。

70℃保温30min，取2μl进行连接反应。

肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。

(完整版)细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。

每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。

集落形成率表示细胞的独立生存能力。

各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。

通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。

而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。

然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验胜利的关键是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过年夜.软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系.接种细胞的密度每平方厘米不超越35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验.1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫.2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃.提前融化血清和双抗.3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中坚持.4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔.5、铺下胶：按1:1比例使 1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能发生气泡）.对一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）.6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰卵白酶消化并轻轻奏乐，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成份的稀释水平.每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104.7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中坚持.再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml.待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周.8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥.9、计数克隆：把平皿放置在颠倒显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中年夜于50个克隆数(﹥)和所有克隆数，克隆形成率=年夜于50个克隆数\所有克隆数×100%.每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照.10、数据处置：每个视野的面积是1mm22,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数×960，如果要比力﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就获得总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比力.。

克隆形成琼脂平板.doc

学海无涯
克隆形成-琼脂平板
1、(细胞被干预（药物处理，转染，电转，感染）24小时后，作活细胞计数（台盼蓝染色），用完全培养基调整细胞密度至1×105 /ml（活细胞）；
2、(用超纯水分别配制1%的标准琼脂糖和0.7%的低溶点琼脂糖，高压灭菌后4℃保存，使用时，微波炉加热溶解，然后放在40℃水浴中至少平衡30min；
3、按1:1比例把1%的标准琼脂糖和完全培养基混合后，取1.5mL混合液加入35mm平皿中，冷却凝固作为底层琼脂；
4、把0.75 ml 0.7%的低溶点琼脂糖和0.75 ml完全培养基混合后，再向管中加入5,10,15,20,25或30μl细胞悬液，充分混匀，加入铺有底层琼脂的35mm平皿中，待上层琼脂凝固后，加入0.5-1ml完全培养基，置入37℃，5%CO2温箱中培养7-14天，每隔3-4天更换培养液；
5、待细胞克隆长至合适大小（100-200uM）取出，结晶紫染色，然后把盖子拿掉，用照相机拍照，注意拍6孔板的全貌, 手工计数克隆的数量，对数据进行统计分析；
6、实验周期比较长，一定要注意无菌操作，可以在培养液中加抗生素防止污染；注意事项：
1. 每孔接种细胞的数量，上面设计了6个细胞梯度，已经充分考虑了各种细胞的大小与生长速度；
3. 注意无菌操作，整个检测窗口为期7-14天，期间污染风险一定要控制；
4. 细胞接种至6孔板是否继续进行细胞干预？决定于处理因素起作用的时间；。

软琼脂克隆形成实验步骤完整版

软琼脂克隆形成实验步骤完整版集团公司文件内部编码：（TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。

接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

提前融化血清和双抗。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。

对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。

每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。

软琼脂克隆形成实验(特选内容)

软琼脂克隆形成实验原理及步骤原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。

某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。

单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。

半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。

步骤：1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

提前融化血清和双抗。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。

对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。

软琼脂克隆形成试验

克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。

而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。

(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。

一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。

(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。

然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。

(完整版)软琼脂克隆形成实验

软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 配制含20%FBS、2X双抗PS的2X1640培养基，用0.2微米的滤器过滤除菌。
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞悬液。
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。
软琼脂克隆形成实验
（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
一、实验原理
➢ 某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆能力反映其恶性增殖程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗检验等方面。
➢ 让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟Байду номын сангаас内细胞处于半固液的情况，在此情况下检测细胞的增殖能力。单细胞处于软琼脂中，就如同胰酶消化后的状态，此后，细胞继续增殖分裂，形成单克隆。

克隆形成实验步骤

克隆形成实验步骤克隆形成是生物学中一种重要的现象，它指的是在自然界或实验室中，通过人工手段复制生物体的基因或细胞，使其形成与原始生物相同或相似的个体。

克隆形成实验是一项研究克隆技术的关键实验，下面将详细介绍克隆形成实验的步骤。

第一步：选取合适的供体细胞在进行克隆形成实验之前，需要选择一种适合的供体细胞。

供体细胞的选择应根据具体实验目的来确定，可以选择动物或植物的体细胞作为供体细胞。

在实验中，常用的供体细胞有皮肤细胞、肌肉细胞等。

第二步：收集供体细胞样本在选定供体细胞后，需要收集供体细胞样本。

对于动物细胞，可以通过取样或活体取样的方式获取供体细胞样本；对于植物细胞，一般选择叶片或茎段等组织作为供体细胞样本。

第三步：处理供体细胞样本处理供体细胞样本的目的是为了提取出供体细胞的DNA或核酸物质。

常用的处理方法有机械分离、化学分离和酶解等。

通过这些方法，可以将供体细胞样本中的DNA或核酸物质分离出来，为下一步的克隆形成提供基础。

第四步：制备受体细胞制备受体细胞是进行克隆形成实验的重要步骤之一。

受体细胞是指接受供体细胞DNA或核酸物质的细胞。

在实验中，受体细胞可以是卵细胞、受精卵或干细胞等。

制备受体细胞的方法有多种，可以通过体外培养、体内提取等方式获取受体细胞。

第五步：将供体细胞与受体细胞结合将供体细胞与受体细胞进行结合是克隆形成实验的关键步骤。

常用的结合方式有细胞融合、细胞注射和细胞电穿孔等。

通过这些方式，可以将供体细胞的基因或细胞注入到受体细胞中，使其形成克隆体。

第六步：培养克隆体将克隆体培养是克隆形成实验的最后一步。

在培养过程中，需要提供适宜的环境和培养基，以促进克隆体的正常生长和发育。

同时，还需要注意对克隆体进行细胞分化和体细胞重编程等处理，以确保克隆体的稳定性和可行性。

通过以上六个步骤，克隆形成实验可以顺利进行。

通过克隆形成实验，可以获得与供体细胞相同或相似的克隆体，为研究生物学、医学等领域提供重要的实验材料和研究对象。

克隆形成实验

克隆形成实验克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

软琼脂法实验服务周期及流程

软琼脂法实验服务周期及流程
软琼脂法实验是一种测定细胞转化及致瘤性的实验方法。

该实验需要细胞锚定非依赖性生长状态（肿瘤细胞生长特性）。

相比于2D单层培养，该3D培养法的生长条件可以更准确地反映出癌细胞的自然生长环境，因此动物实验进行之前的软琼脂法实验是至关重要的。

实验前，将细胞（用致癌物质或致癌物抑制剂处理的）于软琼脂培养21-28天。

而后，克隆子可经细胞染色法进行形态学分析并且计数。

实验流程：
1. 基层琼脂
2. 在基层琼脂上加入细胞琼脂，培养6-8天
3. 形成克隆子
4. 溶解琼脂（形成均质细胞悬液）
5. 细胞溶解并检测。

克隆形成实验

克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

克隆形成实验

克隆形成实验
克隆形成实验（Clone Formation Assay）是一种常用的体外细胞生物学实验方法，主要用于评估单个细胞的增殖能力和独立生存能力。

在这个实验中，通常将单个细胞或极低密度的细胞接种到培养皿中，并在适宜的条件下培养一段时间（例如几周）。

在此期间，能够生长和分裂的细胞会逐渐形成一个由大量同源细胞组成的集落，这个集落就被称为“克隆”。

实验步骤主要包括：
1. 细胞准备：选择待测细胞并进行适当的处理，如标记、药物处理等。

2. 稀释与接种：将细胞以极低浓度（通常是单细胞/孔）接种到平板上，确保每个孔内只有一个细胞或者极少数几个细胞。

3. 培养：在恒温、恒湿及无菌条件下培养细胞一段时间，让它们贴壁并开始增殖。

4. 观察与计数：经过足够长时间后（一般认为当克隆包含50个以上细胞时可视作有效克隆），使用显微镜观察并记录形成克隆的细胞数量。

5. 计算克隆形成率：根据形成克隆的孔数除以总的接种孔数，再乘以100%，得到的就是克隆形成率（Clone Formation Efficiency, CFE），它反映了细胞群体中具有独立生存与增殖能力的细胞比例。

通过克隆形成实验，可以研究细胞增殖特性、检测细胞毒性、评价细胞转化状态（正常细胞与肿瘤细胞的差异）、鉴定干细胞活性等多种生物学问题。

此外，在药物筛选和辐射损伤修复等领域也有广泛应用。

软琼脂克隆形成试验

克隆形成试验软琼脂克隆形成试验克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁地细胞数，但贴壁后地细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆地细胞必为贴壁和有增殖活力地细胞.克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状.由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强.并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养.、平板克隆形成试验基本步骤：()取对数生长期地单层培养细胞，用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在胎牛血清地培养液中备用.()将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当地细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中.一般分每皿、、个细胞地梯度密度分别接种含℃预温培养液地皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀.置℃及饱和湿度地环境下，静置培养～周.()经常观察，当培养皿中出现肉眼可见地克隆时，终止培养.弃去上清液，用小心浸洗次.加纯甲醇或醋酸甲醇，固定分钟.然后去固定液，加适量应用染色液染～分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥.()将平皿倒置并叠加一张带网格地透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于个细胞地克隆数.最后计算克隆形成率.克隆数克隆形成率—————×接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长地细胞.适宜底物为玻璃地、塑料瓶皿.试验成功地关键是细胞悬液地制备和接种密度.细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大.、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：()取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含胎牛血清地培养液调整细胞密度至×细胞.然后根据实验要求作梯度倍数稀释.()用蒸馏水分别制备出和两个浓度地低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在℃中不会凝固. ()按比例使地琼脂糖和×培养基(含有×抗生素和地小牛血清)混合后，取混合液注入直径平皿中(平皿加～)，冷却凝固，可作底层琼脂置温箱中备用.()按比例让地琼脂糖和×培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入地细胞悬液，充分混匀，注入铺有琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后，置入℃温箱中培养～天.()把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数.计算形成率.软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系.试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过℃.接种细胞地密度每平方厘米不超过个，一般地平皿接种个细胞.正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验.软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)将％低熔点琼脂糖与×细胞培养基以地体积比混合制备％地底层琼脂，孔板中每个孔温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为个，将％低熔点琼脂糖与×细胞培养基以地体积比混合，制备％地上层琼脂，每孔加上层琼脂和单细胞悬液（约)，混匀，室温凝固.置于℃，％地细胞培养箱中培养－周，计数含个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，采集图像.。

[分享]软琼脂集落形成实验

[分享]软琼脂集落形成实验给你找了几个试验方法:1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。

把培养板移入CO2 孵箱,在37 ?、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2,3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm 或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。

2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37?培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g(L-1和12 g(L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45?水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45?水浴保温. 将2×DMEM与12 g(L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4?放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g(L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个(L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37?，50 mL(L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在 35 mm的平皿中长至 70,,80,铺满，然后与 20 μμmol? I-1的AS,ODN。

共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制 6mL? L-1的底层琼脂，lml,孔加入 24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL? L-1的琼脂混合，以每孔 0.5 mL中含 500个细胞加到底层琼脂上，置37?培养 2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。

细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。

每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。

集落形成率表示细胞的独立生存能力。

各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。

通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。

而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。

然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。