最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混 合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝 固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消 化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调 整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞 悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿 接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细 胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用 此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬 液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形 成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞 生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱 ，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状 态。
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Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
细胞克隆形成实验步骤及方法
细胞克隆形成实验步骤及方法细胞克隆形成实验步骤及方法一、技术简介细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。
实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。
由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
二、实验流程A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。
1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。
3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
6. 结果统计分析。
B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。
1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。
2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。
3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。
4. 加入细胞悬液，待上层琼脂凝固后，培养10-14天。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2〜3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10〜30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
Colony Formation Assay
软琼脂克隆形成实验(Colony Formation Assay)一、材料低熔点琼脂糖、2糖DMEM培养基、各种稳定细胞系、倒置显微镜和数码相机、水浴锅、0.1%结晶紫溶液、10/15ml的管二、实验方法1. 用小水浴锅用去离子水洗净，调水温到50℃。
（一般实验进行过程中保持水浴锅温度在50℃左右，以保证琼脂不凝固。
）2. 用小三角瓶配制浓度为1.4%和0.8%的琼脂溶液，高压灭菌，然后放到50℃水浴锅中保持不凝固状态；（要用小的三角瓶配置，防止使用过程中琼脂凝固导致实验失败。
）3. 取适量的2 量的止使培养基，置于50℃水浴锅中，平衡10 分钟左右；（最好用多少加多少，节省时间，防止琼脂凝固。
）4. 按照1:1 比例取适量的平衡好的2取适量的平衡和1.4%的琼脂溶液培养基，放到一个干净的50ml离心管中混匀，不要弄出气泡；（注意：此过程需迅速完成，可选用5ml大号枪头，以防琼脂凝固；琼脂在用之前必须保证在50℃水浴锅中，处于溶液状态，不能凝固，因为一旦凝固，将不能进行实验。
）5. 在6 孔板中每孔加入1 ml 步骤4 的混合液，冷却凝固，细胞培养箱中静置晾干待用。
（此过程需要边往孔里加边摇晃，使混合液均匀地铺满6孔板，切忌幅度太大，出现气泡；过程也需迅速凝固，防止凝固或铺板不均匀）6. 取待分析的生长状态良好的细胞计数，稀释成5状态良5个/ml。
取出100状态良细胞液，加到4 ml按1:1 比例的混好的2的混好的好培养基和0.8%的琼脂中；（此步骤需要用胎盼蓝计数，配置成足够的细胞悬液，以备实验使用）7. 取1ml 步骤6 中混匀的细胞悬液，加到铺有下层胶的6 孔板中，每组三个重复；可以做两个细胞浓度；8. 待上层琼脂完全凝固后，再加入0.5-1ml 1再加入层胶的细胞培养基(加入相应抗生素)，置于37℃CO2细胞培养箱培养，每三天补加细胞培养基；（注意：应加入20%的胎牛血清）9. 2-3 周后在倒置显微镜下观察并统计集落数；10. 小心吸干上层培养基，向每孔加入400 ul 0.1%结晶紫染色液，染色15-30分钟；11. 用数码相机或显微镜拍照，统计，作图分析。
colonyformationassay实验方法
c o l o n y f o r m a t i o n a s s a y实验方法(总1页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。
一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。
然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
soft agar protocol
Soft agar Assay
准备工作
灭菌玻璃瓶2个，灭菌水1瓶
1.25%Agar（6.25g/500ml）
Glutamine(谷氨酸盐)，Gentamicin(庆大霉素)
预先算好化合物的浓度及配制方法，可配2-3次的用量用于重复实验
乘有44°温水的塑料泡沫盒用以放配好的Agar
流程
44°水浴锅融化1.25%Agar。
根据需要配不同浓度的化合物(头天晚上预算好，用DMSO配，1:1000的浓度)，转入标记好的15ml管壁上，盖上盖子防止化合物挥发，因化合物量太少。
将10ml Agar加入15ml管中，使化合物混匀在Agar中，每孔中加3mlAgar，等待1h后Agar凝固，即为下层胶。
在下层胶凝固期间准备细胞，消化，加10%FBS-BME吹打使其成单个，然后进行细胞计数。
计数后用10%FBS-BME稀释到2.4*104,(如为成对验证的细胞可在稀释后加到一个空白六孔板中镜下观察其浓度，浓度相同非常重要，否则后面结果不可信)吸取 1.2ml到15ml管中（已添加同下层胶同浓度化合物），加2.4mlAgar，每孔中加1mlAgar，此时细胞浓度为8000/ml。
上层胶凝固需30-40min，待完全凝固后再放回培养箱。
六孔板三个为一组，下层胶需3ml，上层胶需1ml。
所以下层配10ml，上层配3.6ml。
软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性
活性分析软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性*齐乃松1，2，郭建3，王雪1，文海若1**（1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京100176；2.河南省食品药品检验所，郑州450003；3.首都医科大学附属北京同仁医院急诊科，北京100730）摘要 目的：分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件，并对冬凌草甲素（oridonin，ORI）的抑瘤性和没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）促瘤性进行评价。
方法：1）摸索实验条件：采用6孔板固态培养法，按不同密度（每孔500~20 000个）将肿瘤细胞系（Hela，K562和HepG2）和转化细胞系（Bhas 42）与软琼脂混合铺板，计数克隆形成率。
2）HepG2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50 μg·mL-1的ORI溶液混合后铺板；Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3 μg·mL-1的EG溶液处理后，镜下观察细胞达到转化状态后，与软琼脂混合铺板培养。
经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。
3）利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。
结果：细胞接种密度为每孔1 000 个左右时，利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。
ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低HepG2细胞的克隆形成率（P<0.01），且对细胞增殖有抑制作用。
EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率（P<0.01），但对细胞增殖影响不显著。
结论：软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标，可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。
该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。
两者的有机结合，可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。
关键词：软琼脂克隆形成实验；试验条件；肿瘤细胞系；转化细胞系；成瘤性；抑瘤性；冬凌草甲素；没食子酸乙酯中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2017）03-0444-07doi：10.16155/j.0254-1793.2017.03.12Tumor suppression effect and tumorigenicity of drugsevaluated by soft agar colony formation assay*QI Nai-song1，2，GUO Jian3，WANG Xue1，WEN Hai-ruo1**（1．Beijing Key Laboratory，National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China；2．Henan Provincial Institute of Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；3．Emergency Department，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730，China）Abstract Objective：To zinvestigate the appropriate conditions for soft agar colony formation assay using tumor and transformed cell lines，and evaluate the tumor suppression effect of oridonin（ORI）and the tumorigenicity of * 国家“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-002）；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题（2014C1）；北京市自然科学基金项目（7142127） ** 通信作者 Tel：（010）67876252；E-mail：wenhairuo@ 第一作者 Tel：185********；E-mail：qinaisongcpu@ethyl gallate（EG）respectively．Methods：1）Experimental conditions：tumor cell lines（Hela，K562 and HepG2）and transformed cell line（Bhas 42）were mixed with soft agar on 6-well culturing plates at different density（500-20 000 cells per well），and the colony formation rates were calculated．2）HepG2 cells were mixed with ORI at concentrations of 0.016，0.08，0.4，2，10，50 μg·mL-1；Bhas 42 cells were pretreated with EG at concentrations of 0.3，1，3 μg·mL-1 and subsequently plated with soft agar while the transformation state was observed．The effects of ORI and EG on colony formation rates were examined．3）Effects of ORI and EG on cell cycles were analyzed by flow cytometry．Results：Both tumor cells and transformed cells achieved optimized effects when the cells were plated at the density of 1 000 cell per well．ORI as an antitumor drug significantly reduced the clone formation rate（P<0.01）and exhib ited inhibition effect on proliferation of HepG2 cells．EG was able to increase the clone formation rate in a concentration-dependent pattern，but had no effect on the cell proliferation．Conclusion：In the soft agar colony formation assay，clone formation rate is used to estimate the tumor suppression effect and the tumorigenicity induced by drugs in a simple and sensitive manner．Our colony formation assay results are consistent with the cell cycle analysis data．By combining both methods，drug-induced cell proliferation and tumor suppression/ tumorgenicity could be effectively predicted．Keywords：soft agar colony formation assay；test conditions；tumor cell lines；transformed cell lines；tumorigenicity；tumor suppression effect；oridonin；ethyl gallate软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行评价。
肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验
Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。
软琼脂克隆形成实验(特选内容)
软琼脂克隆形成实验原理及步骤原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。
某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。
单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。
半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。
步骤：1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。
对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
colonyformationassay实验方法
colonyformationassay实验方法1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。
一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。
然后去固定液，加适量Giemsa 应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验之老阳三干创作当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆.每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间.集落形成率暗示细胞的独立生存能力.各类理化因素可能导致细胞的克隆形成能力产生改动.通过一定的实验办法可以对细胞的克隆形成能力进行检测.细胞接种存活率只暗示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞.克隆形成率反应细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状.由于细胞生物学性状不合,细胞克隆形成率不同也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强.实验办法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系.平板克隆形成实验基本步调：1、取对数生长期的各组细胞,辨别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用.2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞辨别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度辨别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分离均匀.置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周.3、经常不雅察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养.弃去上清液,用PBS小心浸洗2次.加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟.然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气枯燥.4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数.最后计算克隆形成率.克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验办法简单,适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验成功的关头是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分离得好,不克不及有细胞团,接种密度不克不及过大.平板克隆形成试验办法简单,适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验成功的关头是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分离得好,不克不及有细胞团,接种密度不克不及过大.软琼脂培养克隆形成试验基本步调：(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L.然后按照实验要求作梯度倍数稀释. (2)用蒸馏水辨别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固.(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用.(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天.(5)把平皿放置在倒置显微镜下,不雅察细胞克隆数.计算形成率. 软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系.试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超出40℃.接种细胞的密度每平方厘米不超出35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞.正常细胞在悬浮状态下不克不及增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验.软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)将 1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂,6 孔板中每个孔 1.4ml 温室凝固,取对数期细胞,胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数,并调细胞浓度为10000 个/ml,将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合,制备0.3％的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well),混匀,室温凝固.置于37℃,5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周,计数含50 个细胞以上得克隆,计算细胞集落形成率,SpotII 收集图像.注意事项1.接种时细胞密度适度,不成过高.2.软琼脂与细胞混合时温度不克不及超出40℃,不然将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定,若频频加热,容易降解而产生毒性,且硬度下降.因此高压灭菌后应进行分装；4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分离度,不然结果的准确度会受到很大影响；5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降,永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%,甚至无法形成单个克隆.因此,为了提高克隆形成率,有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质.6.细胞接种存活率只暗示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分离成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养.。
UBE2T增强乳腺癌细胞干细胞特性的作用及其机制研究-细胞生物学专业毕业论文
CONTENTSChinese abstract 1 English abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5 Abbreviation．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9 Introduction．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10Materials and Methods．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1：! Results．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：17 Discussion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：；：；Figures．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：；6 References．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．49 Acknowledgments．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．!；：；Published Papers．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．!；。
Protocols for Soft Agar Assay软琼脂分析肿瘤细胞操作程序
4. Place the 6-well plate into the 5% CO2 humidified incubator.
Байду номын сангаас
5. To maintain cell viability, overlay additional 1-1.5 ml 0.4% agar in culture medium (with 10% serum and 1X antibiotics) onto each well once a week or when medium starts turning yellow.
2. DMEM or RPMI powder
3. FBS
4. 2X culture medium (with 20% serum and 2X antibiotics), filtered, store at 4 ?C.
Procedures:
1. Boil water in a glass beaker, melt the 1.2% agar in the boiling water. When the agar is completely melted, transfer appropriate volume of the agar into a tube kept at 45 ?C. Meanwhile, 2X (with serum and antibiotics, e.g. DMEM + 20% FCS for mouse fibroblasts NIH 3T3) are warmed up to 37 ?C.
6. Starting the 10th day, colonies may be observed. Count colonies after 3 weeks under a microscope (10X magnification is enough).
软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性
活性分析软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性*齐乃松1，2，郭建3，王雪1，文海若1**（1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京100176；2.河南省食品药品检验所，郑州450003；3.首都医科大学附属北京同仁医院急诊科，北京100730）摘要 目的：分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件，并对冬凌草甲素（oridonin，ORI）的抑瘤性和没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）促瘤性进行评价。
方法：1）摸索实验条件：采用6孔板固态培养法，按不同密度（每孔500~20 000个）将肿瘤细胞系（Hela，K562和HepG2）和转化细胞系（Bhas 42）与软琼脂混合铺板，计数克隆形成率。
2）HepG2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50 μg·mL-1的ORI溶液混合后铺板；Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3 μg·mL-1的EG溶液处理后，镜下观察细胞达到转化状态后，与软琼脂混合铺板培养。
经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。
3）利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。
结果：细胞接种密度为每孔1 000 个左右时，利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。
ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低HepG2细胞的克隆形成率（P<0.01），且对细胞增殖有抑制作用。
EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率（P<0.01），但对细胞增殖影响不显著。
结论：软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标，可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。
该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。
两者的有机结合，可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。
关键词：软琼脂克隆形成实验；试验条件；肿瘤细胞系；转化细胞系；成瘤性；抑瘤性；冬凌草甲素；没食子酸乙酯中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2017）03-0444-07doi：10.16155/j.0254-1793.2017.03.12Tumor suppression effect and tumorigenicity of drugsevaluated by soft agar colony formation assay*QI Nai-song1，2，GUO Jian3，WANG Xue1，WEN Hai-ruo1**（1．Beijing Key Laboratory，National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China；2．Henan Provincial Institute of Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；3．Emergency Department，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730，China）Abstract Objective：To zinvestigate the appropriate conditions for soft agar colony formation assay using tumor and transformed cell lines，and evaluate the tumor suppression effect of oridonin（ORI）and the tumorigenicity of * 国家“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-002）；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题（2014C1）；北京市自然科学基金项目（7142127） ** 通信作者 Tel：（010）67876252；E-mail：wenhairuo@ 第一作者 Tel：185********；E-mail：qinaisongcpu@ethyl gallate（EG）respectively．Methods：1）Experimental conditions：tumor cell lines（Hela，K562 and HepG2）and transformed cell line（Bhas 42）were mixed with soft agar on 6-well culturing plates at different density（500-20 000 cells per well），and the colony formation rates were calculated．2）HepG2 cells were mixed with ORI at concentrations of 0.016，0.08，0.4，2，10，50 μg·mL-1；Bhas 42 cells were pretreated with EG at concentrations of 0.3，1，3 μg·mL-1 and subsequently plated with soft agar while the transformation state was observed．The effects of ORI and EG on colony formation rates were examined．3）Effects of ORI and EG on cell cycles were analyzed by flow cytometry．Results：Both tumor cells and transformed cells achieved optimized effects when the cells were plated at the density of 1 000 cell per well．ORI as an antitumor drug significantly reduced the clone formation rate（P<0.01）and exhib ited inhibition effect on proliferation of HepG2 cells．EG was able to increase the clone formation rate in a concentration-dependent pattern，but had no effect on the cell proliferation．Conclusion：In the soft agar colony formation assay，clone formation rate is used to estimate the tumor suppression effect and the tumorigenicity induced by drugs in a simple and sensitive manner．Our colony formation assay results are consistent with the cell cycle analysis data．By combining both methods，drug-induced cell proliferation and tumor suppression/ tumorgenicity could be effectively predicted．Keywords：soft agar colony formation assay；test conditions；tumor cell lines；transformed cell lines；tumorigenicity；tumor suppression effect；oridonin；ethyl gallate软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行评价。
黄芪对肺腺癌细胞生长抑制的实验研究
黄芪对肺腺癌细胞生长抑制的实验研究耿国军;姜杰;杜好信;钱文轩;张义;杨丽华;陈端扬;陈隽鹏【摘要】目的:研究分化诱导剂黄芪(Astragalus)在体外对人肺腺癌SPC-A-1细胞生长抑制的影响.方法:用不同浓度的黄芪分别处理肺腺癌SPC-A-1细胞后,镜下观察癌细胞的生长情况;测定软琼脂克隆形成率;MTT(噻唑蓝)法测定生长抑制率.结果:不同浓度黄芪处理后细胞的生长明显受到抑制,细胞生长抑制率随黄芪的浓度增加而增加.结论:黄芪对肺腺癌SPC-A-1细胞的生长有明显的抑制作用.【期刊名称】《实用中西医结合临床》【年(卷),期】2011(011)001【总页数】2页(P4-5)【关键词】黄芪;肺腺癌;SPC-A-1;MTT法;生长抑制【作者】耿国军;姜杰;杜好信;钱文轩;张义;杨丽华;陈端扬;陈隽鹏【作者单位】福建省厦门市中医院,厦门,361000;福建省厦门市中医院,厦门,361000;福建省厦门市中医院,厦门,361000;福建省厦门市中医院,厦门,361000;福建省厦门市中医院,厦门,361000;厦门大学医学院,福建厦门,361009;福建省厦门市中医院,厦门,361000;福建省厦门市中医院,厦门,361000【正文语种】中文【中图分类】R285.5近年研究表明，黄芪具有提高免疫、增强造血、增强细胞代谢、清除自由基、抗肿瘤免疫应答等作用[1]。
为探讨黄芪对肺腺癌细胞的生长抑制作用，本研究选择肺腺癌细胞进行体外实验，通过一定浓度的黄芪处理肺腺癌细胞一定时间后，观察其对肺腺癌细胞的生长抑制效果，为临床治疗肺癌提供一定的理论依据。
1.1 材料黄芪购自浙江杭州，配制为20 g/L的无菌溶液备用。
流式细胞仪，为美国产品。
SPC-A-1细胞株为厦门大学生命科学学院提供。
小牛血清购自上海江莱生物科技有限公司，实验时选用对数生长期细胞。
1.2 细胞培养观察增殖力随机取5瓶处于对数生长期的SPC-A-1细胞，在其中的4瓶内加入不同浓度的黄芪（0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL）。
[分享]软琼脂集落形成实验
![[分享]软琼脂集落形成实验](https://img.taocdn.com/s3/m/5c34b3aa7c1cfad6185fa73d.png)
[分享]软琼脂集落形成实验给你找了几个试验方法:1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ?、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2,3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm 或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37?培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g(L-1和12 g(L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45?水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45?水浴保温. 将2×DMEM与12 g(L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4?放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g(L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个(L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37?，50 mL(L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在 35 mm的平皿中长至 70,,80,铺满，然后与 20 μμmol? I-1的AS,ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制 6mL? L-1的底层琼脂，lml,孔加入 24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL? L-1的琼脂混合，以每孔 0.5 mL中含 500个细胞加到底层琼脂上，置37?培养 2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容
1.软琼脂克隆形成实验1)配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状态。
2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。
3)灌下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，室温放置待其凝固。
4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞，计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。
5)下层胶凝固后灌上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。
6)37℃5% CO2培养，约2-3周收细胞，0.1%结晶紫染色，计数并比较两组克隆形成情况。
1、人生最重要的不是努力，不是奋斗，而是抉择。
2、老板只能给一个位置，不能给一个未来。
舞台再大，人走茶凉。
3、意外和明天不知道哪个先来。
没有危机是最大的危机，满足现状是最大的陷阱。
4、所见所闻改变一生，不知不觉断送一生。
5、生意，可以掌控努力与投资，却无法掌控结果。
人生得意时找出路，失意时才有退路，宝马都有备胎，您的人生呢？6、世界上有多少有才华的失败者，世界上有很多高学历的无业游民—是因为选择错误。
7、下对注，赢一次；跟对人，赢一世。
8、学识不如知识，知识不如做事，做事不如做人。
9、不识货，半世苦；不识人，一世苦。
10、生命不在于活得长与短，而在于顿悟的早与晚。
11、做人处事，待人接物：重师者王，重友者霸，重己者亡。
12、没有目标的人永远为有目标的人去努力。
13、人生三阶段：比才华；比财力；比境界。
14、人若把自己框在一定的范围内，就容易限制了自己的思维和格局。
15、今天的优势会被明天的趋势代替，把握趋势，把握未来。
16、读万卷书不如行千里路，行千里路不如阅人无数，阅人无数不如名师指路。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
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1.软琼脂克隆形成实验
1)配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状
态。
2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。
3)灌下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，
室温放置待其凝固。
4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞，
计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。
5)下层胶凝固后灌上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃
左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。
6)37℃5% CO2培养，约2-3周收细胞，0.1%结晶紫染色，计数并比较两组克
隆形成情况。
1、人生最重要的不是努力，不是奋斗，而是抉择。
2、老板只能给一个位置，不能给一个未来。
舞台再大，人走茶凉。
3、意外和明天不知道哪个先来。
没有危机是最大的危机，满足现状是最大的陷阱。
4、所见所闻改变一生，不知不觉断送一生。
5、生意，可以掌控努力与投资，却无法掌控结果。
人生得意时找出路，失意时才有退路，宝马都有备胎，您的人生呢？
6、世界上有多少有才华的失败者，世界上有很多高学历的无业游民—是因为选择错误。
7、下对注，赢一次；跟对人，赢一世。
8、学识不如知识，知识不如做事，做事不如做人。
9、不识货，半世苦；不识人，一世苦。
10、生命不在于活得长与短，而在于顿悟的早与晚。
11、做人处事，待人接物：重师者王，重友者霸，重己者亡。
12、没有目标的人永远为有目标的人去努力。
13、人生三阶段：比才华；比财力；比境界。
14、人若把自己框在一定的范围内，就容易限制了自己的思维和格局。
15、今天的优势会被明天的趋势代替，把握趋势，把握未来。
16、读万卷书不如行千里路，行千里路不如阅人无数，阅人无数不如名师指路。
经师易得，人师难求。
17、学历代表过去，财力代表现在，学习力代表将来。
18、人生能走多远，看与谁同行；有多大成就，看有谁指点。
19、聪明的人看得懂，精明的人看得准，高明的人看得远。
20、做人不成功，成功是暂时的；做人成功，不成功也是暂时的。
记住这些话他会帮你变得更完美
记住：
再烦，也别忘微笑；再急，也要注意语气；
再苦，也别忘坚持；再累，也要爱自己。
低调做人，你会一次比一次稳健；高调做事，你会一次比一次优秀。
成功的时候不要忘记过去；失败的时候不要忘记还有未来。
有望得到的要努力，无望得到的不介意，则无论输赢姿态都会好看。
生活不是单行线，一条路走不通，你可以转弯。
泪水和汗水的化学成分相似，但前者只能为你换来同情，后者却可以为你赢的成功。
变老是人生的必修课，变成熟是选修课。
以锻炼为本，学会健康；以修进为本，学会求知；
以进德为本，学会做人；以适应为本，学会生存。