体外乙酰化

体外乙酰化/去乙酰化实验方法

1. GST蛋白表达纯化

接菌：

3mL LB+ 3ul 抗生素+ 一个菌落（经BL-21转化后的）37℃ 225rpm摇菌过夜。

IPTG:

100 mL LB + 100ul 抗生素+ 1ml 菌液，37℃ 225rpm 4h；

4h后，每瓶（100ml）菌液 + 40ul IPTG,30℃ 225rpm 2h；

100ml菌液分装2个50ml离心管，离心4℃，5000rpm,10min,弃上清，置于-20℃保存备用。

GST：

1.将-20℃保存的细胞（一管50ml离心管，另一管保留）置于冰上，加入3ml

冰预冷的PBS，重悬细胞，再加入150ul Triton-100(20%)；

2.将重悬好的细胞转移到15ml离心管中；

3.将超声波细胞破碎仪预热10min；

4.向15ml离心管中加入5ul PIC, 5ul PMSF, 5ul Na

3VO

4

；

5.破碎细胞：次数：6-8次，间隔：60-120s，每次：10-15s

（实际使用：次数：6；间隔：60’’，每次：10’’）；

6.beads预处理：用前混匀，133ul beads，离心4℃，2500rpm，5min，弃上清

（吸取33ul上清，弃之），得100ul beads (2个样品) ;

7.用1ml PBS洗1次beads，混匀，离心4℃，2500rpm，5min，弃上清，+ 150ul

PBS重悬，分装4管，每管62.5ul；

8.将破碎后的3ml样品分装到2个Ep管中，离心4℃，13000rpm，15min，将

上清转移至分装好的beads管中，4℃摇床摇匀过夜or RT 摇床摇匀1h；

9.离心4℃，2500rpm，5min，弃上清；

10.加入预冷PBS 1ml，混匀，离心4℃，2500rpm，5min，弃上清；

11.重复步骤10两遍，即用PBS洗3次；

12.每1个Ep管中加入100ul PBS（即：每3ml原样品对应2支Ep管），4℃保

存。

制备PAGE胶样品：

GST后的样品，取30ul置于已经标记的Ep管中，加入30ul loading Buffer，将该Ep管管盖上扎孔，煮沸5min，置于冰上备用，或-20℃保存。

PAGE 电泳，200V, 40min左右；

电泳后，用考马斯亮蓝染色，过夜，观察并记录结果，如若需要，拍照保存。

2.体外乙酰化反应

在1.5mlEP管中配置乙酰化反应体系，

总体积50ul：

GST-底物：5ug

GST-乙酰化酶： 1ug

Ac-coA: 20uM

Tris-HCl(pH8.0):50uM

EDTA: 0.1mM

DTT: 1mM

甘油： 10%

混匀，30℃，反应1个小时。

反应后，Western blot 用抗乙酰化赖氨酸的抗体（CST）检测乙酰化效果。3.体外去乙酰化反应

乙酰化反应的产物，用去乙酰化反应缓冲液洗涤一次，配置去乙酰化反应体系，总体积50ul：

GST-Ac-底物：5ug

GST-去乙酰化酶：1ug

NAD+: 60uM

Tris-HCl(pH8.0): 25uM

NaCl: 137mM

KCl: 2.7mM

MgCl2: 1mM

30℃，反应1个小时。

反应后，Western blot 用抗乙酰化赖氨酸的抗体（CST）检测乙酰化效果。