植物生理实验报告

本科学生综合性实验报告

项目组长高铭远学号 07070241011

成员杜广宇、杜沙沙、段司宇、冯慧彬、宫亚坡

专业生物技术班级1班

实验项目名称小麦耐盐生理指标测定

指导教师及职称尉连伶讲师

开课学期 2008 至 2009 学年 2 学期

上课时间2009 年 4 月 22日

植物耐盐性生理指标的测定

一、实验目的及要求

通过本实验的学习，使学生掌握脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量测定方法，掌握单因子方差分析，培养学生离心机和分光光度计的使用技能，为今后撰写毕业论文打下良好的基础。

二、实验主要仪器和试剂

仪器:离心机；分光光度计；恒温水浴锅

试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA

三、实验原理

植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm 处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。

植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长

在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

四、实验步骤

（一）实验材料的培养

小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。

（二）盐胁迫处理

用100 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。

（三）脯氨酸含量测定

1.标准曲线的制作

用100μg/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3% 磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

2.脯氨酸的提取

称取小麦叶片0.5g，加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，5000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。

3.反应体系

取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm 处测得A值。

4. 脯氨酸的含量的计算

从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯

氨酸的微克数表示（μg/g）。

（四）过氧化物酶活性的测定

1.过氧化物酶的提取

称取小麦叶片0.2g，加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4℃，5000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液

2.反应体系

50μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔1min记一次数值，连续记录三次，取平均值。

3.酶活力定义

过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A 为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min·g

（五）丙二醛含量测定

1.丙二醛提取

小麦叶片0.5g，加入10﹪三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)和少量石英砂充分研磨，匀浆液以5000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。

2.反应体系

取2mL提取液，分别加入2mL 0.6﹪TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL 水代替提取液调零。

3.MDA含量计算：

根据C＝6.45×A

532－0.56×A

450

，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计

算出每克样品中丙二醛的含量(μmol/g（FW)。

五、实验结果

标准液浓度

（ug/ml）

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

A值0 0.021 0.047 0.065 0.085 0.102

原始数据：

对照处理

A 值含量或活性

（FW）A 值含量或活性

（FW）

脯氨酸含量1. 0.047

2. 0.051

3. 0.053

1.109.6719

2.119.3528

3.12

4.1933

1. 0.117

2. 0.187

3. 0.306

1.279.0875

2.448.5030

3.736.5095

POD 活性1.A值

0.448，0.569，0.684，0.786

差值0.121，0.115，0.102

2.A值

0.541，0.717，0.875，1.021

差值0.176，0.158，0.146

3.A值

0.701，0.880，1.046，1.196

差值0.179，0.166，0.150

1. 11266.67

2. 16000

3. 16500

1.A值

0.877，1.112，1.322，1.511

差值0.235，0.210，0.189

2.A值

1.112，1.389，1.622，1.807

差值0.277，0.233，0.185

3.A值

1.139，1.434，1.676，1.869

差值0.295，0.242，0.193

1. 21133.33

2. 23166.67

3. 24333.33

丙二醛含量1.A450=0.408A532=0.196

2.A450=0.397A532=0.199

3.A450=0.443A532=0.205

1. 51.786

2. 5

3.0615

3. 53.7085

1.A450=0.544A532=0.202

2.A450=0.447A532=0.201

3.A450=0.504A532=0.186

1. 49.913

2. 52.3065

3. 45.873

单因子方差分析结果：

对照处理

脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b