脂肪酶修饰研究进展_付海霞

脂肪酶修饰研究进展

付海霞，杨国龙，毕艳兰，孙尚德

（河南工业大学粮油食品学院，　河南郑州　450001）

摘　要：脂肪酶广泛应用于食品、化工和生物技术等领域，反应体系涉及溶剂体系和水相体系；为

提高脂肪酶在反应中活性和稳定性，可采取多种方法对脂肪酶进行修饰。该文对脂肪酶修饰方法进行综述。关键词：脂肪酶；酶修饰；酶

Research progress on modification of lipases

FU Hai-xia ，YANG Guo-long ，BI Yan-lan ，SUN Shang-de

（College of Food Science and Technology ，Henan University of Technology ，Zhenzhou 450001，Henan ，China ）

Abstract ：L ipa s e s were us ed widely in f oo d ，ch e m i c al engineering and bi o te ch n o l o gy ，and t h e rea c ti o n s cou ld be d o ne in so lvent and aq u e ous s y s te m. In o rder t o i m pr o ve t h e rea c ti o n a c tivity and s tability ，m any m et ho d s were applied t o mo dify t h e lipa s e in t h e re s ear ch. Th e m et ho d s f o r mo difi c ati o n o f lipa s e s were reviewed in t h i s arti c le .Key words ：lipa s e ；en z y m i c mo difi c ati o n ；en z y m e 中图分类号：TS201.2＋5

文献标识码：A

文章编号：

1008―9578（2013）01―0001―04收稿日期：2012–11–29基金项目：国家自然科学基金项目（31071558）作者简介：付海霞（1986~ ），女，硕士研究生，研究方向：油脂化学。通信作者：杨国龙（1974~ ），男，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：脂质化学与生物技术。

脂肪酶（EC 3.1.1.3）能催化脂肪酸酯水解、醇解、

酸解、酯交换及脂肪酸酯化反应，广泛应用于食品、化工、医药、纺织等领域；脂肪酶可应用于水相反应，亦可应用于非水相反应〔1–2〕。脂肪酶系由生物细胞所分泌、以蛋白质为主要成分生物催化剂，具有选择性好、催化活性高、反应条件温和、环保无污染等特点〔3–4〕。但天然脂肪酶在实际应用中仍存在一些问题，如游离酶与产物分离困难、游离酶不易回收重复利用、游离酶稳定性差等。为解决天然脂肪酶在实际应用中存在问题，研究者采用多种方法对其进行修饰，以改善其

功能〔2，4〕。

酶修饰化技术始于20世纪50年代，并很快应用

于工业化生产〔5〕

。酶修饰目的有：定向修饰酶催化活性中心氨基酸残基，揭示酶活性中心构成及催化机理；修饰与组成酶活性中心无关氨基酸侧链，改善酶的应用性能及酶原有催化功能或创造新功能；酶与其它物质（或化合物）通过非共价键相互作用，改善酶的表面

特性或应用特性〔2–3，5〕

。根据修饰中酶与修饰分子间作用力不同，可将酶的修饰方法分为共价修饰和非共价修饰。

1 脂肪酶共价修饰1.1 大分子修饰脂肪酶

很多大分子经活化可用以修饰脂肪酶，如聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖苷、甲壳素和壳聚糖及其衍生物等。

聚乙二醇（PEG）是一种单功能聚合物，具有一系列不同分子量产品，其无毒副作用、无刺激性、无免疫原性，并具良好水溶性，与许多有机物组份呈良好相溶性。20世纪70年代后期，PEG 对蛋白质化学修饰

已有很多报道。Abuchowski 〔6〕

研究发现，经PEG 修

饰蛋白质作为药物比未修饰蛋白质有效许多。PEG

主要通过改变蛋白分子侧链基团或分子中主链结构对脂肪酶进行修饰，按PEG 修饰基团不同可将之分为氨基修饰、巯基修饰、羧基修饰等。但PEG 用于脂肪酶化学修饰必须活化，因此PEG 修饰一般可分为两步：首先，将PEG 予以活化处理，使其连接一个活性基团，以便其与酶蛋白分子某些功能基团结合，然后将经活化PEG 与酶进行共价结合。目前，最常用活化剂有：氰尿酰氯（三聚氯氰）、三氟乙烷磺酰氯、氯甲酸–P –硝基苯酯、N –羟基琥珀酰亚胺等。其中三聚氯氰是一种常用活化剂，价格低廉、容易获得；但毒性较大，且有可能会影响酶活性。脂肪酶经活化PEG 修饰后，可提高其在有机溶剂中溶解性和稳定性；但酶活可能会有不同程度改变。用硝基苯基氯仿、氰尿酸氯化物活化的PEG 修饰念珠菌属脂肪酶，修饰酶在异辛烷中稳定性和活力均提高许多〔7〕。而用对硝基苯―氯甲酸酯活化PEG，再用此活化PEG 修饰C.rugosa 类VII 脂肪酶（CRL），修饰虽降低酶活性，但提高酶稳定 性〔8〕。经PEG 修饰后可提高酶在有机溶剂中稳定性和溶解性；但PEG 修饰脂肪酶在存在少量水条件下才能在酯化反应和酰基交换反应体系中发挥其活力，同时少量水的存在可使反应逆向进行。

甲壳素是一种在自然界储量丰富天然多糖，对蛋白质呈有高亲和性，有许多反应基团，是一种具多功能基团高分子化合物，可发生多种反应。甲壳素部分水解脱乙酰基可得到壳聚糖。甲壳素、壳聚糖均存在氨基，能与酶蛋白共价结合，又能螯合金属离子，

使金属离子不能抑制酶活性〔9〕

。脱酰壳聚糖也可通过戊二醛偶联到酶分子上。黄朋〔10〕、Lee 等〔11〕采用

Fe3O4化学沉淀法合成一种磁性高分子微球，通过固定化修饰脂肪酶，可提高脂肪酶耐受性、酶使用次数和时间，及脂肪酶活力回收。研究发现，化学修饰可能会改变脂肪酶在有机溶剂中催化反应，多种修饰剂对Candida rugosa脂肪酶进行修饰，都显著提高其在有机溶剂中的对应体选择性〔12〕。

1.2 小分子化合物修饰脂肪酶

脂肪酶分子可离解基团，如氨基、羧基、羟基、巯基、咪锉基等，都可被其它活性基团修饰。小分子修饰法就是利用醛、酮、羧酸、脂肪酸等小分子化合物与这些游离基团发生烷基化、酰化、醚化等反应，通过改变侧链羟基性质以达到修饰目的。其中赖氨酸末端ε–NH2，因具较强亲核性，可在温和条件下与很多亲电试剂反应，有利于修饰过程中酶活性保持而成为常用官能团之一。上述这些修饰反应可稳定酶分子、有利于增强催化活性、提高抗变性能力。例如，脱氨基作用能消除脂肪酶分子表面氨基酸电荷，改善脂肪酶稳定性；酰化反应，则能改变侧链羟基性质等。常用小分子化合物主要有：邻苯二酸酐、丙酮、醋酸酐、硬脂酸等。翁永珍等〔13〕采用N–羟基琥珀酰亚胺活化法以硬脂酸对Lipolase脂肪酶进行化学修饰，发现Lipolase脂肪酶经硬脂酸修饰后提高界面活性并有利于其在有机相或两相界面催化化学反应；且Lipolase 脂肪酶经活化硬脂酸修饰后，同时具有亲水基和疏水基，与未修饰酶相比，疏水性增强。Means等〔14〕报道用乙醛和丙酮借助于与氨基形成Schiff碱对蛋白质进行修饰。于忠良等〔15〕对硝基苯酚丁酸酯、二乙基焦炭酸盐、苯甲基磺酰氟、2–硝基苯甲酸、N–溴代琥珀酰亚胺、1–乙基–碳二亚胺盐酸盐等化学修饰剂对根霉ZM–10脂肪酶活性部位羧基、咪唑基、吲哚基、巯基等氨基酸残基进行修饰，研究氨基酸残基对酶活性影响。熊亚红等〔16〕采用邻苯二甲酸酐对猪胰脂肪酶进行化学修饰，修饰后酶催化水解效率及酶与底物亲和力得到有效提高，也增强酶分子热稳定性。小分子修饰条件温和，不会对脂肪酶蛋白构象产生不利影响，也不会影响修饰酶反应最佳条件，且小分子修饰同时会改变脂肪酶一些性质。例如，小分子修饰脂肪酶不但能改善酶分散性、提高酶表面活性及使酶表面产生新的物理、化学、机械性能及新功能，还能改善酶与其它物质相容性〔17〕。

2 脂肪酶非共价修饰

2.1 吸附法〔5〕

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活损失小；但酶与载体作用力小、易脱落。物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定在载体表面。载体主要有：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基―葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。谭天伟等〔18〕研究一种简单的用硅藻土固定猪胰脂肪酶方法，选择合适pH、酶量及温

度，脂肪酶固定量可达1 020 U/g；用于棕榈油甘油解合成单甘油酯时，固定化酶热稳定性比游离酶强、使用寿命长、具有一定应用潜力。

2.2 包埋法〔5〕

包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作为载体；另外，包埋法只适于作用于小分子的底物和产物酶。网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有：硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。赵江等〔19〕将海藻酸钠胰酶水溶液（3%海藻酸钠、0.7%胰酶）静置成胶液后滴入2% CaCl2溶液中制成微球，对制成后酶的特性进行测定，固定化酶最适反应温度为55 ℃，最适pH为8.0，酶活力回收率为35.4%，反应10次后酶活力仍保持56%，贮藏49 d后酶活力能保持为初始活力75.23%。

2.3 表面活性剂―蛋白质相互作用修饰法

表面活性剂―蛋白质相互作用修饰法是近20多年来开发又一种酶的修饰方法。脂肪酶作为一种蛋白质，其表面性质以亲水性为主，但也存在一定疏水性基团〔20〕。非离子表面活性剂―脂肪酶间会通过两种主要作用力产生相互作用；即表面活性剂亲水性基团―脂肪酶表面亲水性基团间氢键、和表面活性剂疏水性基团―脂肪酶表面疏水性基团间分子间作用力（或疏水相互作用）〔20–21〕。

Okahata等〔22〕于1988年提出表面活性剂修饰酶概念，报道表面活性剂―酶（surfactant coated lipase，也有译为“包衣酶”）概念和制备方法后，因其具有制备简便、酶活损失小、有机溶剂选择范围广、酶表面含水量低、包衣酶稳定性高等其它方法所不具备优点，特别适于催化酯化、酯交换等不希望有水存在反应，引起人们广泛关注。其制备方法为：将25 ml含50 mg脂肪酶的醋酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 5.6）与25 ml含50 mg二烷基两亲物分散剂溶液充分混合，在4 ℃下保温24 h，冷冻干燥。与未修饰酶在有机相中催化反应相比，表面活性剂修饰酶具有催化活性高、有机溶剂选择范围广等显著优点。

Goto等〔23〕研究如何获得合适表面活性剂修饰酶制备条件。经表面活性剂修饰后能极大提高脂肪酶在有机溶剂中活性，表面活性剂修饰酶反应速率是粉末脂肪酶的100倍，表面活性剂修饰脂肪酶酯交换转化率高于粉末脂肪酶。通过动力学分析，醇底物能抑制脂肪酸酶促酯交换。Goto等〔24〕研究采用表面活性剂包衣酶用聚乙烯微胶囊固定化技术，表面活性剂包衣酶催化酯化反应速率为原酶粉3倍，90%固定化后酶可重复使用六次。Sadafumi Noda等〔25〕对表面活性剂包衣脂肪酶进行研究，研究发现，包衣后脂肪酶