T-SPOT诊断结核感染
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6
免疫学诊断
PPD皮肤试验
抗体检测
假阳性率高 48-72h读取结果
敏感性、特异性差
7
WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求 禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于 肺结核和肺外结核的诊断。
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
T-SPOT.TB的临床意义
T-SPOT.TB高特异性
ESAT-6＆CFP 10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域
仅结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1区基因 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 （M.gordonae、M.kansasii、M.marinum、M.szulgai） T-SPOT.TB不会受卡介苗接种及其他分枝杆菌的影响
27
T-SPOT.TB的临床意义
在结核病治疗中的评价意义
效应T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴 性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之 一。
28
T-SPOT.TB的缺点
仍有一定的假阳性及假阴性结果 实验结果是对结核感染的判断，阳性结 果包括了活动性结核及潜伏性结核感染 的可能，需要结合临床来确诊是否是结 核病患者 不能够提示临床患者的病变部位，需要 结合临床来判断
200万人死于结核。
我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核 感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的 2倍以上。
4
中国是结核感染高负担国家
患者人数占全球的14.3%，具体表现 为“五多” 感染人数多—5.5亿人感染过结 核 患病人数多—现有活动性肺结核 患者500万 潜伏感染人数多—受限于检测条 件较难统计，2009年流行病调 查结果为总人口的44.5%（因采 用PPD检测，假阳性较多） 新发患者多—仅活动性肺结核 2009年新发病患107万 死亡人数多—13万/年
31
检测结果
•外周血T-SPOT.TB：阳性 •心包积液T-SPOT.TB：阳性 •诊断：结核性心包炎 •治疗： INH、RFP、PZA、 EMB、强的松 •体会：诊断快速 – 心包积液结核培养 6周后报阳
32
病例2
•患者，女性，60岁，浙江温州人 •主诉：反复发热2月余，头痛2周伴意识障碍2天 •外院头颅MRI见脑实质内弥漫性点状、结节状及环形病灶。
γ 干扰素 检测阴性
γ 干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
17
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染 后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰 素 r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要 的细胞因子
19
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
包
20
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
患者体内存在 针对MTB的效 应T淋巴细胞
患者体内不含 针对MTB的效 应T淋巴细胞
21
T-SPOT.TB的临床意义
T-SPOT.TB高灵敏度
22
T-SPOT.TB的临床意义
种类 活动性结核/灵 敏度 内容摘要 将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结果进 行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的患者。TSPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%） 在经培养确诊的活动性结核受试者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 96.6%。其中29例免疫力低下患者，T-SPOT.TB的灵敏度为 100% 在确诊病例（涂片或培养阳性）和临床诊断病例（有临床症状 和抗痨治疗有效）中，T-SPOT.TB的灵敏度为90.3%，并且不 受CD4细胞数量影响。 在经痰培养或肺部病变组织病理活检确诊的结核患者中，TSPOT.TB的灵敏度为92%。 在确诊的肺结核患者和疑似肺外结核患者中，T-SPOT.TB的阳 性率94%。 在免疫力正常和免疫力低下的受试人群中，T-SPOT.TB的灵敏 度分别为94%和95%。所有受试者中，42%为肺外结核患者。 经培养确诊、抗痨治疗不超过2周的结核患者用T-SPOT.TB检测， 阳性率98%（57/58）。 在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 94%。 在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 94.1%。 受试者数 量 72 文献发表
18
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
T-SPOT.TB技术：
利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存 在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异 抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋
巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
29
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
30
病例1
•患者，男，35岁 •患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动则气急，
无咳嗽，咯血，盗汗 。
•胸片：两肺（－），右侧胸腔积液，心包积液 •心超：心包积液 •心包穿刺：血性 •诊断：肿瘤？结核？细菌感染？……
8
细菌学诊断
抗酸染色涂片 分枝杆菌培养
阳性率低
含菌量≥1万/mL痰液
需时4-6周
9
快速培养系统
1. BD BACTEC MGIT 960培
养系统
2. BacT ALERT 3D培养系统
10
分子生物学诊断
•实时荧光定量PCR技术：HRM •线性探针耐多药检测技术：HAIN技术 •基因芯片
•PCR –电离质谱检测技术
5
结核的传统诊断手段
结核菌素皮试： 低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。 低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性” 结果。 免疫学诊断 ─ 抗原、抗体（胶体金） 细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周； 涂片阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。 病理学检查：阳性率低，对取材有较高要求，有创伤，对肉芽Байду номын сангаас性病变 需进一步鉴别。 分子生物学诊断 ─ PCR 影像学检查
7.5mg。
•2天后患者体温即平，意识障碍好转 •脑脊液T-SPOT.TB：阳性 •诊断：倾向结核性脑膜脑炎
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
15
21世纪结核检测的重大突破
γ-干扰素释放实验（IGRAs)被商化（2006 年），用于结核感染的检测
将结核菌特异性抗原加入含受试者的血液标本的 培养基中进行孵化，如果受试者受到过MTB感染， 那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异 性抗原产生反应，发生增殖分化并释放γ -干扰 素 通过定量检测γ -干扰素的释放水平，来诊断MTB 感染 16 T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点试验)
47
95
218
Storla et al. BMC Infectious Diseases 2009,9:60
25
T-SPOT.TB 的高特异性与灵敏度， 给临床准确、快速的诊断结果
• 特异性
美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306)
国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508)
Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65 Kim et al. Arch Intern Med. 2007; 167;20:2255-2259 Kim et al. Am J Med 2009；122, 189-195 Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8 Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008; 15;168-71 Chee et al J Clin Microbiol. 23 2008; 46(6):1935-40
11
病理学检查
阳性率低 对取材有较高要求，有创伤 对肉芽肿性病变需进一步鉴别
12
影像学检查
目前诊断活动性肺结核的重要手段，尤其 是粟粒性肺结核 对潜伏性结核诊断价值不大 对肺外结核诊断价值不大
13
现有检测手段不能满足临床要求
假阴性：免疫力低下或HIV人群，新生儿、 老弱人群，药物影响； 假阳性：BCG接种人群，其它分支杆菌感 染，交叉污染 肺外的结核感染无法明确诊断 抗痨治疗疗效无法评价 无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植 手术治疗后病患免疫力下降，引发结核， 形成医疗事故 14
• 灵敏度
美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655)
26
T-SPOT.TB的临床意义
基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集 中的特点， T-SPOT.TB的检测物已不局 限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、 胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外 结核的诊断。 敏感性优于ADA、TB-DNA，约在6275%，特异性无统计学差异。
T-SPOT.TB诊断结核感染 临床应用进展
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
2
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
3
结核的现状
结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO 统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约
A substandard test with unreliable results • TB can be wrongly diagnosed • A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice • Problems of misdiagnosis • The inaccurate serological tests are costly • Selling substandard tests with unreliable results
Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis (2005)；24: 529-536 Lee et al. ERJ 2006; 28:24–30
87
30
Clark et al. Clin. Exp. Imm. 2007; 150(2):238-44
140 32 186 58 32 270
24
T-SPOT.TB的临床意义
种类 特异性 内容摘要 用T-SPOT.TB检测14例鸟分枝杆菌感染者，13例阴性，1例为临 界值，复查也为阴性。 经过结核筛查的无症状的受试者，T-SPOT.TB检测结果全部为 阴性，特异性100%。 在德国用T-SPOT.TB对健康的卫生保健工作者进行筛查。仅1例 阳性（1/95） ，为影像学工作者，接触病人超过35年。 TST检 测假阳性结果34% （32/95）。 在接触结核的健康医务工作者和健康对照受试者中用TST和TSPOT.TB检测。155健康医务工作者中，TST阳性的27例，而TSPOT.TB仅3例阳性。健康对照组T-SPOT.TB全部阴性而TST有 3例阳性。 受试者数 量 14 文献发表 Adams et al Sc. J Inf. Dis.. 2008;40(3):196-203. Clark et al. Clin. Exp. Imm. 2007; 150(2):238-44 Barsegian et al. J of Hospital Inf 2008；69(1):69-76
•有皮肌炎史，外院予激素治疗
33
腰穿
•压力250mmH2O，有核细胞420x106/L，糖
0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物
136mmol/L
•隐球菌乳胶凝集试验：阴性
34
治疗：抗细菌+抗结核
•美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙 胺丁醇治疗，同时予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天
免疫学诊断
PPD皮肤试验
抗体检测
假阳性率高 48-72h读取结果
敏感性、特异性差
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WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求 禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于 肺结核和肺外结核的诊断。
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
T-SPOT.TB的临床意义
T-SPOT.TB高特异性
ESAT-6＆CFP 10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域
仅结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1区基因 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 （M.gordonae、M.kansasii、M.marinum、M.szulgai） T-SPOT.TB不会受卡介苗接种及其他分枝杆菌的影响
27
T-SPOT.TB的临床意义
在结核病治疗中的评价意义
效应T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴 性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之 一。
28
T-SPOT.TB的缺点
仍有一定的假阳性及假阴性结果 实验结果是对结核感染的判断，阳性结 果包括了活动性结核及潜伏性结核感染 的可能，需要结合临床来确诊是否是结 核病患者 不能够提示临床患者的病变部位，需要 结合临床来判断
200万人死于结核。
我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核 感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的 2倍以上。
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中国是结核感染高负担国家
患者人数占全球的14.3%，具体表现 为“五多” 感染人数多—5.5亿人感染过结 核 患病人数多—现有活动性肺结核 患者500万 潜伏感染人数多—受限于检测条 件较难统计，2009年流行病调 查结果为总人口的44.5%（因采 用PPD检测，假阳性较多） 新发患者多—仅活动性肺结核 2009年新发病患107万 死亡人数多—13万/年
31
检测结果
•外周血T-SPOT.TB：阳性 •心包积液T-SPOT.TB：阳性 •诊断：结核性心包炎 •治疗： INH、RFP、PZA、 EMB、强的松 •体会：诊断快速 – 心包积液结核培养 6周后报阳
32
病例2
•患者，女性，60岁，浙江温州人 •主诉：反复发热2月余，头痛2周伴意识障碍2天 •外院头颅MRI见脑实质内弥漫性点状、结节状及环形病灶。
γ 干扰素 检测阴性
γ 干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
17
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染 后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰 素 r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要 的细胞因子
19
基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
包
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基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
患者体内存在 针对MTB的效 应T淋巴细胞
患者体内不含 针对MTB的效 应T淋巴细胞
21
T-SPOT.TB的临床意义
T-SPOT.TB高灵敏度
22
T-SPOT.TB的临床意义
种类 活动性结核/灵 敏度 内容摘要 将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结果进 行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的患者。TSPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%） 在经培养确诊的活动性结核受试者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 96.6%。其中29例免疫力低下患者，T-SPOT.TB的灵敏度为 100% 在确诊病例（涂片或培养阳性）和临床诊断病例（有临床症状 和抗痨治疗有效）中，T-SPOT.TB的灵敏度为90.3%，并且不 受CD4细胞数量影响。 在经痰培养或肺部病变组织病理活检确诊的结核患者中，TSPOT.TB的灵敏度为92%。 在确诊的肺结核患者和疑似肺外结核患者中，T-SPOT.TB的阳 性率94%。 在免疫力正常和免疫力低下的受试人群中，T-SPOT.TB的灵敏 度分别为94%和95%。所有受试者中，42%为肺外结核患者。 经培养确诊、抗痨治疗不超过2周的结核患者用T-SPOT.TB检测， 阳性率98%（57/58）。 在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 94%。 在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为 94.1%。 受试者数 量 72 文献发表
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基于T淋巴细胞检测结核感染的原理
T-SPOT.TB技术：
利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存 在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异 抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋
巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
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主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
30
病例1
•患者，男，35岁 •患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动则气急，
无咳嗽，咯血，盗汗 。
•胸片：两肺（－），右侧胸腔积液，心包积液 •心超：心包积液 •心包穿刺：血性 •诊断：肿瘤？结核？细菌感染？……
8
细菌学诊断
抗酸染色涂片 分枝杆菌培养
阳性率低
含菌量≥1万/mL痰液
需时4-6周
9
快速培养系统
1. BD BACTEC MGIT 960培
养系统
2. BacT ALERT 3D培养系统
10
分子生物学诊断
•实时荧光定量PCR技术：HRM •线性探针耐多药检测技术：HAIN技术 •基因芯片
•PCR –电离质谱检测技术
5
结核的传统诊断手段
结核菌素皮试： 低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。 低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性” 结果。 免疫学诊断 ─ 抗原、抗体（胶体金） 细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周； 涂片阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。 病理学检查：阳性率低，对取材有较高要求，有创伤，对肉芽Байду номын сангаас性病变 需进一步鉴别。 分子生物学诊断 ─ PCR 影像学检查
7.5mg。
•2天后患者体温即平，意识障碍好转 •脑脊液T-SPOT.TB：阳性 •诊断：倾向结核性脑膜脑炎
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
15
21世纪结核检测的重大突破
γ-干扰素释放实验（IGRAs)被商化（2006 年），用于结核感染的检测
将结核菌特异性抗原加入含受试者的血液标本的 培养基中进行孵化，如果受试者受到过MTB感染， 那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异 性抗原产生反应，发生增殖分化并释放γ -干扰 素 通过定量检测γ -干扰素的释放水平，来诊断MTB 感染 16 T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点试验)
47
95
218
Storla et al. BMC Infectious Diseases 2009,9:60
25
T-SPOT.TB 的高特异性与灵敏度， 给临床准确、快速的诊断结果
• 特异性
美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306)
国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508)
Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65 Kim et al. Arch Intern Med. 2007; 167;20:2255-2259 Kim et al. Am J Med 2009；122, 189-195 Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8 Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008; 15;168-71 Chee et al J Clin Microbiol. 23 2008; 46(6):1935-40
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病理学检查
阳性率低 对取材有较高要求，有创伤 对肉芽肿性病变需进一步鉴别
12
影像学检查
目前诊断活动性肺结核的重要手段，尤其 是粟粒性肺结核 对潜伏性结核诊断价值不大 对肺外结核诊断价值不大
13
现有检测手段不能满足临床要求
假阴性：免疫力低下或HIV人群，新生儿、 老弱人群，药物影响； 假阳性：BCG接种人群，其它分支杆菌感 染，交叉污染 肺外的结核感染无法明确诊断 抗痨治疗疗效无法评价 无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植 手术治疗后病患免疫力下降，引发结核， 形成医疗事故 14
• 灵敏度
美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655)
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T-SPOT.TB的临床意义
基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集 中的特点， T-SPOT.TB的检测物已不局 限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、 胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外 结核的诊断。 敏感性优于ADA、TB-DNA，约在6275%，特异性无统计学差异。
T-SPOT.TB诊断结核感染 临床应用进展
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
2
主要内容
结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用
3
结核的现状
结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO 统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约
A substandard test with unreliable results • TB can be wrongly diagnosed • A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice • Problems of misdiagnosis • The inaccurate serological tests are costly • Selling substandard tests with unreliable results
Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis (2005)；24: 529-536 Lee et al. ERJ 2006; 28:24–30
87
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Clark et al. Clin. Exp. Imm. 2007; 150(2):238-44
140 32 186 58 32 270
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T-SPOT.TB的临床意义
种类 特异性 内容摘要 用T-SPOT.TB检测14例鸟分枝杆菌感染者，13例阴性，1例为临 界值，复查也为阴性。 经过结核筛查的无症状的受试者，T-SPOT.TB检测结果全部为 阴性，特异性100%。 在德国用T-SPOT.TB对健康的卫生保健工作者进行筛查。仅1例 阳性（1/95） ，为影像学工作者，接触病人超过35年。 TST检 测假阳性结果34% （32/95）。 在接触结核的健康医务工作者和健康对照受试者中用TST和TSPOT.TB检测。155健康医务工作者中，TST阳性的27例，而TSPOT.TB仅3例阳性。健康对照组T-SPOT.TB全部阴性而TST有 3例阳性。 受试者数 量 14 文献发表 Adams et al Sc. J Inf. Dis.. 2008;40(3):196-203. Clark et al. Clin. Exp. Imm. 2007; 150(2):238-44 Barsegian et al. J of Hospital Inf 2008；69(1):69-76
•有皮肌炎史，外院予激素治疗
33
腰穿
•压力250mmH2O，有核细胞420x106/L，糖
0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物
136mmol/L
•隐球菌乳胶凝集试验：阴性
34
治疗：抗细菌+抗结核
•美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙 胺丁醇治疗，同时予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天