吸附层析法柱层析法
柱层析去除杂质的原理
柱层析去除杂质的原理柱层析法是一种分离和纯化化学物质的常用方法，它通过利用化学物质在固定相和流动相之间的差异而实现分离。
柱层析法一般包括固态柱层析和液态柱层析两种。
固态柱层析是指利用固定在柱子内壁上的固定相与待分离物质之间的相互作用进行分离。
这种柱层析方法主要包括吸附层析、分配层析和离子交换层析。
其中，吸附层析是利用物质在固定相表面上的吸附性质进行分离。
例如，固定相可以是一种多孔性材料，具有很大的表面积，待分离物质可以通过在adsorbent表面上吸附，从而被分离出来。
分配层析是利用物质在固定相和流动相之间的不同分配系数进行分离。
例如，固定相可以是一种涂覆在柱壁上的有机液体，待分离物质会根据其在固定相和流动相中的溶解度分布在两相中，从而被分离出来。
离子交换层析是利用物质在固定相上带电的功能基团与待分离物质之间的电荷作用进行分离。
例如，固定相可以是一种带有离子交换基团的树脂，待分离物质可以通过与树脂上的离子交换基团形成离子交换相互作用而被分离出来。
液态柱层析是指利用液相作为流动相进行分离的柱层析方法。
常见的液态柱层析方法包括凝胶层析、分子筛层析和离子交换层析。
凝胶层析是利用流动相在固定相中扩散的速率差异进行分离。
例如，固定相可以是一种具有多孔结构的凝胶，待分离物质可以通过在凝胶中的扩散速率不同而被分离出来。
分子筛层析是利用物质在固定相中的分子尺寸选择性吸附作用进行分离。
例如，固定相可以是一种具有特定孔径大小的分子筛材料，待分离物质可以通过与分子筛表面相互作用而被分离出来。
离子交换层析的原理同固态柱层析中的离子交换层析一样。
柱层析法去除杂质的原理主要是利用化学物质与固相表面或流动相之间的相互作用力的不同，使杂质和目标物质分开。
这种分离原理是基于化学物质的性质差异，如溶解度、吸附性、电荷等。
在柱层析过程中，流动相通过固定相时，固定相上的功能基团会与化合物之间发生物理或化学的相互作用，导致化合物在固相和流动相之间发生分配和吸附，进而实现分离纯化。
柱层析的原理
柱层析的原理柱层析的原理柱层析法是化学分离技术中最常用的方法之一。
它是通过不同物质成分在沿着柱子表面的不同程度的吸附和脱附过程来实现物质分离的。
该技术被广泛应用于药物分离、食品分析、环境监测等领域。
本文将介绍柱层析的原理。
一、柱层析的分类柱层析法可分为气相层析和液相层析两大类。
气相层析法包括气相色谱法和蒸汽层析法；液相层析法则有离子交换、凝胶层析和亲和层析三种。
二、柱层析的原理1. 化学吸附在柱层析法中，柱填料是的一个重要组成部分。
柱填料的作用是为了在样品进入柱子后产生必要的应力，以使得各种成分在填料表面上发生吸附作用。
其中，化学吸附是柱层析法的一种常见吸附方式。
这种吸附机制是利用填料表面的化学活性位点进行吸附。
这种吸附力比物理吸附强得多，因此能够很好地用于各种物质的分离。
2. 物理吸附物理吸附是另一种柱层析法中较为常见的吸附方式。
这种吸附机理是利用填料表面的各种物理位点来吸附分离样品中的物质。
由于物理吸附的力量较小，因此在某些分离工作中能够获得比化学吸附更好的效果。
例如，物理吸附能够实现非极性物质与某些化合物的分离。
3. 分配作用分配作用是利用某些化合物在两相溶液中的溶解性差异来实现柱层析分离的机制。
在柱层析过程中，物质通常被分为一个液态相和一个固态相。
当样品混合物在固态相和液态相之间移动时，在不同的物性和沸点温度下，样品混合物的不同成分就能够被定向分离。
本文介绍的三种机制都是柱层析法中常见的基本机制。
柱层析法相对于其他物理化学方法，不仅可以高效地减小样品的杂质，同时还具有操作技术上的便利性和操作成本的低廉价值。
柱层析法的应用越来越广泛，成为现代化学领域中一个不可或缺的工具。
随着科技的不断进步，相信在未来的发展中，柱层析法会成为更广泛应用的分离技术之一。
(完整版)柱层析的操作步骤和注意事项
柱层析技术常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
非凡是在轻易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想假如柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而假如样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较轻易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
假如所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm 的柱子）；假如相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
柱层析法的原理和方法ppt课件
实验案例讨论与经验分享
案例介绍
介绍几个典型的柱层析法应用案例，包括实验设 计、操作过程、结果分析等。
经验分享
分享实验过程中积累的操作技巧、注意事项、故 障排除等方面的经验。
互动交流
鼓励与会者提问、分享自己的实验经验和心得， 进行深入的讨论和交流。
总结与展望
06
柱层析法原理与方法的总结回顾
柱层析法原理
方法 调整流动相的组成和pH值
优化柱温和流速
参数优化的方法和原则
• 选择合适的色谱柱和填料
参数优化的方法和原则
原则 通过实验确定最佳参数组合
根据目标物质的性质和分离要求进行参数优化 注意避免参数变化过大，以免对分离效果造成不利影响
结果分析方法和技术
方法 峰面积和峰高比较法
标准曲线法
结果分析方法和技术
离、纯化和鉴定。
生物样品分析
柱层析法可用于生物样品中痕量 物质的分离和分析，如生物碱、 氨基酸等，提高分析的灵敏度和
准确性。
柱层析法在食品安全检测中的应用实例
01
农药残留检测
柱层析法可用于食品中农药残留的分离和检测，通过合适的填料和洗脱
条件，将农药与食品中的其他成分分离，提高检测的准确性和可靠性。
发展历程
自20世纪初开始，柱层析法逐渐从基础的实验室技术发展为高效、自动化的现 代分离分析方法。
柱层析法的重要性和应用
重要性
柱层析法在化学、生物、医药、环境等领域发挥着重要作用 ，为复杂混合物的分离和纯化提供了有效手段。
应用
药物研发、天然产物提取、环境监测、食品安全等领域广泛 应用柱层析法。
柱层析法的基本原理
实验操作和案例分
05
析
柱层层析法
柱层层析法1. 什么是柱层层析法柱层层析法（Column Chromatography）是一种分离和纯化化合物的常用技术。
它基于化合物在固定相（柱层）和移动相（溶剂）之间的不同亲和性，通过不同程度的分配来实现分离。
2. 柱层层析法的原理柱层层析法的原理基于化合物在柱层中的分配行为。
柱层通常由多孔性固体填充而成，填充物可以是硅胶、氧化铝或其他吸附剂。
移动相则是溶剂，可以是单一溶剂或溶剂混合物。
当样品溶液经过柱层时，不同的化合物会因其与固定相的亲和性不同而以不同速度移动。
较亲和固定相的化合物会被较牢固地吸附在柱层上，而较亲和移动相的化合物则会更快地通过柱层。
这样，化合物就会在柱层中被分离开来。
3. 柱层层析法的步骤柱层层析法通常包括以下步骤：3.1. 准备柱层首先，选择合适的柱层填充物，并将其装填到柱层中。
填充物的选择应根据化合物的性质和需求进行，常用的填充物有硅胶和氧化铝。
3.2. 平衡柱层将柱层与移动相进行平衡，使填充物充分吸附溶剂。
3.3. 样品加载将待分离的化合物样品溶液加载到柱层的顶部。
注意，样品溶液应预先与移动相进行适当的预处理和溶解。
3.4. 洗脱化合物通过逐步改变移动相的组成或使用不同的移动相，将化合物从柱层中洗脱出来。
洗脱时应注意控制溶剂流速和溶剂比例，以保证化合物的有效分离和纯化。
3.5. 收集洗脱液将洗脱液收集起来，通常使用试管或收集瓶。
根据需要，可以将收集的洗脱液进行进一步处理和分析。
4. 柱层层析法的应用柱层层析法广泛应用于化学、生物化学和制药领域。
它可以用于分离和纯化天然产物、合成化合物、蛋白质和核酸等多种化合物。
4.1. 天然产物的提取与纯化柱层层析法可以用于从天然产物中提取和纯化目标化合物。
通过合理选择填充物和移动相，可以实现对复杂混合物中目标化合物的高效分离和纯化。
4.2. 合成化合物的纯化柱层层析法也常用于合成化合物的纯化。
通过柱层层析，可以将化学反应的产物与副产物分离开来，从而获得纯度较高的目标化合物。
吸附柱层析实验结果讨论
吸附柱层析实验结果讨论
吸附柱层析实验是一种常见的色谱分离方法，通过利用样品成分在吸附剂表面的不同亲和力，分离和纯化出不同的物质。
本实验采用了正相吸附柱进行层析分离，根据结果可得出以下结论和讨论。
首先，实验结果表明了本实验利用正相吸附柱的确可以有效地分离不同疏水性化合物，这与我们的假设相符合。
经过试验对比可以看到，样品组分在吸附柱中的吸附时间和出峰顺序与其亲和力相关，疏水性较弱的化合物更容易在吸附剂表面停留更长时间，出峰顺序也更靠后。
因此，通过调整样品的pH值、盐度等参数可以有效地改变组分之间的相互作用力，从而实现更好的分离效果。
其次，吸附柱层析实验的结果还揭示出了吸附剂的重要性。
重点在于吸附剂的种类和质量，如果吸附剂质量不好或是不适合本实验分离的化合物，会使得分离效果不理想。
因此，在选择吸附剂的时候应该根据需要选择适合的类型，同时也需要对吸附剂进行质量检测和优化，以保证实验分离效果的有效性。
最后，本实验的结果对于吸附柱层析的应用具有一定的指导意义。
通过实验，我们可以确定合适的操作条件和优化实验参数，以更好地应用吸附柱层析方法来分离不同疏水性化合物。
同时，也为层析法在科学研究和化学工业中的应用提供了更加全面和详细的理论支持，为优化分离流程和提高纯度提供了有效的技术支持和指导。
柱层析法的原理和方法
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二、操作
1.装 柱
湿法
1.将溶剂装入管 内， 2.将吸附剂和溶 剂 调成浆状，倒入 管 中， 3.使溶剂流出， 吸附剂下沉
干法
1. 管上端放一 漏斗
2.将硅胶装入 3.轻敲管壁使之
填装均匀
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吸附剂
种类：氧化铝、硅胶，氧化镁、碳酸钙和活性炭等 。 ➢ 氧化铝有酸、碱、中性。适用于不同类型化合物 的分离。 ➢ 硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分 离。
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吸附剂的选择
a.与被吸附物及展开剂均无化学作用（首要 ）
b.吸附能力的大小（颗粒大小） c.吸附剂的活性（含水量） d.分子极性
增加淋洗剂的流动 速度，减少产品收
集的时间
分离效果最好
减少硅胶的使用量， 但是由于大量的空 气通过硅胶会使溶 剂挥发
降低分离效果，减 少产品的塔板数
分离时间过长，效 率过差
有些比较易分解的 东西可能得不到而 且还必须同时使用 水泵抽气
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5.收集
• 根据样品中各组分的吸附能力判断流出 的各组分
• 洗脱剂的选择：根据点板的比移值（简称Rf值）。
Rf
值
原点到所需要点的中距心离 原点到溶剂前沿的距离
洗脱剂极性比较：
己烷、石油醚<环己烷<四氯化碳<三氟乙烯 <二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<三氯甲烷< 乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水< 吡啶<乙酸
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4.分类
分类
柱层析详解PPT.
❖ 影响分离的参数
层析法是分离混合物的常用方法, 许多可以改变的因素使层析法 成为一种多方面适用的方法. 这些因素包括: ➢ 1. 选定的吸附剂 ➢ 2. 选定的溶剂极性 ➢ 3. 相对于需待分离的物料量的柱子尺寸(长度和直径) ➢ 4. 洗脱(或流动) 的速率
A.吸附剂
•
(3)
针吸灸人附中穴剂位的。 选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定.
行人。只有服从交通警察的指挥，才会有良好的交通秩序，才能保证车辆和行人的安全。
（4）怎样把我们今天认识的交通标志和交通法规让更多的人都知道？
制定硅开发酸潜在镁客:户分的方离案 乙酰化的糖类, 甾体化合物和香精油.
小提示96：需要与应聘者谈论确认书的细节。
广告的载体和内容决定了申请者的类型、数量以及能否招到合适的人选。对于要求特殊技能的招聘广告应登在行业出版物上，一般的
柱层析详解
CONFIDENTIAL
Column Chromatogra的参数 ❖ 装柱 ❖ 上样 ❖ 洗脱技术 ❖ 柱的监控
❖原理
➢ 有机化学家能用的最现代化和尖端的方法全部包括某种类型的层析法. 层析 法的定义是, 通过在两相之间的分配, 使一个由两种或多种不同化合物(有时 是离子) 组成的混合物得到分离, 这两相中一相是固定的, 另一相则是移动的. 根据所包括的两个相的性质, 可有各种可能形式的层析法; 供普通使用的有 固-液(柱, 薄层和纸), 液-液和气-液(蒸气相) 层析法.
1.7.2核实细节
广泛适用于种种官能团—烃, 醇, 酮, 酯, 羧酸, 偶氮化合物, 胺.
吸附剂
氧化铝: 分为酸性(PH=4), 中性, 碱性(PH=10). 这种吸附剂特别适用于分离象羧
酸和氨基酸之类的酸性物质. 碱性氧化铝的PH约为10, 故适用于分离胺. 中性
柱层析法操作步骤
柱层析法操作步骤嘿，朋友们！今天咱就来聊聊柱层析法操作步骤这档子事儿。
柱层析法呀，就像是一场奇妙的冒险！首先呢，你得准备好你的“冒险装备”，也就是合适的层析柱。
这柱子就好比是你冒险途中的可靠伙伴，得选得称心如意才行。
然后呢，就是装填柱子啦！这可不是随便把东西往里一倒就完事儿的哦。
就像建房子，得一层一层稳稳当当的，不能有丝毫马虎。
把吸附剂均匀地填进去，要填得紧实又恰到好处，这可是个技术活呢。
接下来，就是上样啦！把你要分离的混合物小心翼翼地加进去，就好像给你的“冒险伙伴”送上一份特别的礼物。
这时候可不能毛手毛脚的，得轻点儿，再轻点儿。
上完样，就该开始洗脱啦！洗脱剂就像是给柱子注入了神奇的力量，让不同的物质在柱子里“跑”起来。
有的跑得快，有的跑得慢，就像比赛一样。
你就等着看它们在柱子里展现出各自的“本领”吧。
在这个过程中，你得时刻关注着，就像看着自己的宝贝一样。
观察流出液的颜色、状态，是不是有什么奇妙的变化在发生呢？有时候你会惊喜地发现，哇，想要的东西出来啦！整个过程中，可不能掉以轻心哦。
要像个细心的守护者，随时调整洗脱剂的流速，太快了不行，太慢了也不行，得找到那个恰到好处的节奏。
这不就跟我们过日子一样嘛，得用心去经营，每一个步骤都要认真对待。
要是稍微马虎一点儿，可能就得不到想要的结果啦。
柱层析法，虽然看起来有点复杂，但只要你掌握了这些步骤，再加上一点点耐心和细心，就一定能在这场“冒险”中取得胜利！你想想，当你成功地分离出你想要的物质时，那种成就感，是不是就像攻克了一座难以攀登的山峰一样呢？所以呀，别怕困难，大胆去尝试吧！相信自己，一定能行！总之，柱层析法就是这样一个充满挑战又有趣的过程，让我们一起在这个奇妙的世界里探索吧！。
柱层析的实验方法和技巧
柱层析的实验方法和技巧柱层析法（Column chromatography）是一种常用的化学分离和纯化技术，可以用于从混合物中分离出多种化合物。
本文将介绍柱层析法的实验方法和一些实验技巧。
一、实验方法：1.准备工作：a.准备固定相：将固定相填充到柱中，并充填好；可以使用硅胶、氧化铝或C18等材料作为固定相；b.准备混合物：将待分离化合物溶解在适当的溶剂中；c.准备洗脱剂：根据实验需求选择合适的洗脱剂；2.柱层析操作步骤：a.将固定相填充到柱中。
b.添加适量的固定相保护剂：一般使用不溶于溶剂的物质作为固定相保护剂，以避免固定相的挤压；c.向柱中加入样品溶液，可使用注射器或滴管将样品缓慢滴入；d.加入适量的洗脱剂，使样品溶液通过柱时能够清除杂质；e.收集落下液：通过检测进样后的溶液，根据待分离化合物的特点来控制洗脱剂的加入；f.收集洗脱液：通过改变洗脱剂的性质和量，逐渐改变洗脱液中化合物的组成，实现化合物的分离；g.检测：对收集的液体进行分析和检测，确认化合物的纯度。
二、实验技巧：1.选择合适的固定相：根据待分离物质的性质选择合适的固定相。
一般来说，伯胺、硅胶C（C18）适用于一般的分离，而硅胶S（C2），硅胶A（C4）适用于疏水性化合物的分离，氧化铝适用于酸性物质的分离。
2.控制流速：流速过快会导致分离不彻底，流速过慢则浪费时间。
一般来说，柱床高度不同，流速也会有所不同，对于较长的柱床应采用较快的流速。
3.控制样品量：样品量过多可能会使分离效果不理想，样品量过少则浪费固定相。
应根据待分离化合物的性质和固定相的吸附容量来选择适当的样品量。
4.控制洗脱剂的pH值和溶度：柱层析中的选择性很大程度上取决于洗脱剂的pH值和溶度。
应根据待分离物质的性质和固定相的特点选择合适的洗脱剂。
5.收集洗脱液：在开始柱层析实验时，收集过程中的溶液可能是混合物，因此从开始收集时就需要根据所得的混合物变清的时间点调整洗脱剂的性质和量。
吸附层析
吸附剂的分类
常用的吸附剂有：极性吸附剂和非极性吸附剂两 种 。 极性吸附剂：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造 沸石等。 非极性吸附剂：主要是活性炭。
1.1几种极性吸附剂的简要介绍
(1)硅胶 硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂，具有多孔性网状 结构，它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，容 易制备不同类型，孔径，表面积的多孔性硅胶。 硅胶的吸附能力与吸附物的性质有关，硅胶能吸附非极 性化合物，也能吸附极性化合物，对极性化合物的 吸附能 力更大。硅胶的吸附能力与其本身的含水量密切相关，硅 胶吸附活性随含水量的增加而降低，当含水量小于1%时， 活性最高，而当含水量大于20%时，硅胶的吸附活性最低。 硅胶表面上带有大量的羟基，有很强的亲水性，能吸附 多量水分，因此硅胶一般于105～110摄氏度活化1～2小时后 使用，活化后的硅胶应马上使用。
4、应用
4.1纯化生命物质
使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例1)可纯
化生命物质。
如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋 白质分开，也能把不同结构的核酸分开(见图3-8)。 用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类 等化合物也是有效的。
4.2 分离蛋白质的亚基
一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或Triton X100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生 分子质量不同的蛋白质亚基。
(按体积或时间分管收集)。 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定 。
3.3绘制出洗脱曲线，以每管溶液中样品的浓
度或活性为纵坐标)。 理想的洗脱曲线如图3-7所示。 图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明 样品液中的组分已完全分开。 层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参 数是定性、定量洗脱物的依据。
柱层析法的原理和方法分析
柱层析法的原理和方法分析
简介
柱层析法（column chromatography）是化学分离分析中具有极大的价值的方法，由于它可以将有机混合物分离成许多组分，并可以提取其中的活性组分。
柱层析是一种利用吸附的原理进行物质分离的技术，被广泛应用于有机合成，有机物分析，分析检测，矿物检测，生物化学等领域。
本文将介绍柱层析的原理和操作流程。
一、原理介绍
柱层析是一种利用物质在不同介质中的溶解性和吸附性而基于多种形式的分析方法，主要利用柱体中柱层中溶剂的不同极性和吸附层的不同性质，将物质从混合物中分离出来。
柱层析的原理如下：
1）物质溶解定律：一定优势的溶剂会溶解，而另一定优势的溶剂不能溶解，这叫“物质溶解定律”；
2）溶质和溶剂的吸附：一些离子和分子在植物保护剂层中与当地分子产生强烈的相互作用，有时形成吸附！
3）层析效应：一种溶质在柱体中运动时，它的移动速度一般比另一种溶质的移动速度要快，这种效应叫做层析效应；
4）聚集效应：由于柱体内的相互作用，一些溶质会相互聚集，改变原来的移动速度。
5）滞留效应：一些溶质会在柱体内滞留，而不像其他溶质那样继续移动，这种现象叫滞留效应。
柱层析法的原理介绍
柱层析法的原理介绍
柱层析法是一种物质分离和分析的方法。
它基于样品中的化学物质在柱状固体吸附剂上的不同亲和性，通过控制移动相的流动速度，使不同成分在柱床中以不同的速度和强度被吸附和解吸，从而实现对混合物的分离。
柱层析法的原理主要包括以下几个步骤：
1. 样品进样：将待分离的混合物进样到柱层析柱中。
样品中的成分会被固定相表面上的吸附剂吸附。
2. 洗脱：通过通过移动相的流动，使样品中的成分在柱床中逐渐分离。
移动相的选择是根据样品性质和需求来确定的，可以是液相、气相或两者的组合。
3. 分离：不同成分在柱中的吸附和解吸速度不同，因此在移动相流动的过程中，成分逐渐被分离。
较强的吸附物质会停留在柱中，而较弱的吸附物质会随移动相一起流出。
4. 检测：通过在柱床中进行吸附解吸的成分分别流出后，可以采用各种检测手段来确定和定量各个组分。
常用的检测方法包括紫外光谱、荧光检测、质谱等。
总的来说，柱层析法利用样品中化学物质在固定相表面上的吸附性能不同，通过调控流动相的流速和成分，实现样品的分离、富集和分析。
柱层析原理和操作流程
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柱层析实验报告
一、实验目的1. 了解柱层析的基本原理和操作技术。
2. 掌握利用柱层析分离植物叶片中叶绿素的方法。
3. 通过实验，加深对植物叶绿素成分和结构的认识。
二、实验原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的相互作用，将混合物中的组分进行分离的技术。
本实验采用吸附柱层析法，利用叶绿素能溶于有机溶剂的特性，将植物叶片中的叶绿素提取出来，并通过吸附剂（如氧化铝或硅胶）的吸附作用，使不同成分的叶绿素在柱层析柱中分离。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜植物叶片、无水乙醇、硅胶、氧化铝、洗脱剂（如乙酸乙酯）、层析缸、毛细管、烧杯、玻璃棒、滤纸、剪刀、镊子等。
2. 仪器：柱层析柱、抽滤瓶、电子天平、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 提取叶绿素：将新鲜植物叶片剪碎，加入无水乙醇，用玻璃棒充分研磨，使叶绿素充分溶解。
过滤，收集滤液。
2. 准备柱层析柱：将硅胶或氧化铝均匀铺在柱层析柱底部，用玻璃棒轻轻压紧。
3. 加入样品：用移液器将提取的叶绿素滤液加入柱层析柱，待滤液自然流出。
4. 洗脱：在柱层析柱顶部加入适量洗脱剂，待洗脱剂自然流出。
观察并记录不同颜色成分的流出顺序。
5. 收集分离的叶绿素：将收集到的各组分分别倒入烧杯中，用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，得到分离的叶绿素。
五、结果与分析1. 通过柱层析实验，成功分离出植物叶片中的叶绿素，观察到四种主要成分：叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素。
2. 根据实验结果，叶绿素a和叶绿素b在柱层析柱中的吸附能力较强，先被洗脱出来；胡萝卜素和叶黄素吸附能力较弱，后被洗脱出来。
3. 通过观察分离得到的叶绿素，可以进一步了解植物叶片中叶绿素的成分和结构。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了柱层析的基本原理和操作技术，为今后进行相关实验奠定了基础。
2. 柱层析是一种有效分离混合物中各组分的色谱技术，广泛应用于植物化学、药物分析等领域。
3. 在实验过程中，注意操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
柱层析法的原理和方法分析
柱层析法的原理和方法分析柱层析法是一种分离和分析混合物中组分的常用方法，它基于不同组分在固定相和流动相之间的不同分配行为，通过在填充在柱中的固定相上的流动相中进行分离。
下面将详细介绍柱层析法的原理和方法。
一、原理：柱层析法基于组分在固定相和流动相之间的相互作用差异来实现分离。
其中，固定相是一种特定的吸附剂或分离介质，它占据了柱子的内部空间。
而流动相是运动的溶液，它通过柱子并与固定相接触。
在固定相的作用下，样品中各个组分会以不同的速度通过柱子。
固定相可以通过物理吸附、化学吸附、离子交换、分子筛等方式与不同组分发生相互作用。
这种作用力会使得样品组分在流动相中的速度不同，从而使得各个组分在柱中分离。
通常情况下，移动相的性质和柱子中固定相的选择是需要考虑的关键因素之一二、方法分析：1.实验准备：确定需要分离的混合物，并选择合适的固定相和流动相组合。
准备量取定量混合物溶液，待用。
2.柱装填：将合适的固定相按照一定方法装填到柱子中。
根据需要，可以选择压缩或不压缩填充方法。
3.样品进样：将预先制备好的样品溶液以适量的体积注入柱子，等待分离进程进行。
4.分离过程：打开进样阀，使样品进入柱中。
样品会在固定相和流动相的作用下发生分离，不同组分会以不同的速度移动。
其中，流动相会冲走一些组分，而其他组分会在固定相上发生吸附。
5.检测和结果分析：使用合适的检测手段如紫外可见光谱检测、荧光检测等，在柱的出口位置定时检测样品的组成。
通过不同组分的峰值高度、面积等参数，可以推断出各个组分的浓度和分离效果。
6.结果计算和报告：根据检测结果，计算各个组分的浓度。
最后做出结果报告，包括每个组分的峰值高度、面积，浓度等。
总结：柱层析法是一种常用的分离与分析方法，其原理基于固定相和流动相之间的相互作用差异，通过对混合物中不同组分在固定相和流动相中分配行为的利用来实现分离。
柱层析法的方法包括实验准备、柱装填、样品进样、分离过程、检测和结果分析、结果计算和报告等步骤。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
柱层析知识总结
柱层析知识总结★★★★★★小木虫(金币+1):奖励一下，鼓励发有价值的话题xiazanwen(金币+5):辛苦了2010-08-24 06:34:58枫叶子2006:编辑内容2010-10-24 17:10柱层析利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。
柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。
其中以吸附柱层析应用最广。
以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。
1.吸附柱层析的器材(1)层析柱实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。
如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。
另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。
这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。
用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。
薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。
使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。
将这段玻璃管穿过一个单孔塞。
然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。
用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。
待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。
层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。
柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。
如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。
柱层析方法经验归纳汇总
1、选柱子：有玻璃柱和不锈钢柱两种,实验室常用玻璃柱.径高比一般在1:5-10.根据吸附剂用量（体积)确定柱子大小,一般吸附剂应填充到柱子体积(de)1/4～1/5.柱子可以分为：加压,常压,减压.压力可以增加淋洗剂(de)流动速度,减少产品收集(de)时间,但是会减低柱子(de)塔板数.其他条件相同(de)时候,常压柱是效率最高(de),但是时间也最长,比如天然化合物(de)分离,一个柱子几个月也是有(de).减压柱能够减少硅胶(de)使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量(de)空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解(de)东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气（很大(de)噪音,而且时间长).加压柱是种比较好(de)方法,与常压柱类似,只是外加压力使淋洗剂走(de)快些.压力(de)提供可以是压缩空气,双连球或小气泵.特别在容易分解(de)样品(de)分离中适用.压力不可过大,不然溶剂走(de)太快就会减低分离效果.加压柱在普通(de)有机化合物(de)分离中是比较适用(de).柱子(de)尺寸为粗长(de)最好.柱子越长,相应(de)塔板数就越高.柱子越,上样后样品(de)原点就越小（反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对(de)减小了分离(de)难度.无水无氧柱适用于对氧、水敏感,易分解(de)产品.可以湿柱,也可以干柱.不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出(de)热量有可能是产品分解,毕竟要分离(de)是敏感(de)物质,小心不为过.因为分离(de)物质比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封(de),遵循schlenk操作.至于是加压、常压、减压,随需而定.因为是schlenk 操作,所以点板是个问题,如果样品是显色(de),恭喜了,不用点板,直接看柱子上(de)色带就行了.如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶(de)点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了.无水无氧柱中用(de)比较多(de)是用氧化铝作固定相.因为硅胶中有大量(de)羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物.而氧化铝有碱性、中性和酸性(de),选择余地比较大,但比硅胶要贵些.听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过.2、选择吸附剂：200-300目硅胶,称30-70倍于上样量；如果极难分,也可以用100倍量(de)硅胶.干硅胶(de)视密度在左右,所以要称40 g硅胶,用烧杯量100 ml也可以.书中写硅胶量是样品量(de)30-40倍,具体(de)选择要具体分析.如果所需组分和杂质分(de)比较开(是指在所需组分Rf在,杂质相差以上),就可以少用硅胶.用硅胶作固定相过柱子(de)原理是一个吸附与解吸(de)平衡.所以如果样品与硅胶(de)吸附比较强(de)话,就不容易流出.这样就会发生,后面(de)点先出,而前面(de)点后出.这时可以采用氧化铝作固定相.常用吸附剂(de)种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等.几种常见吸附剂(de)特性（1)氧化铝：市售层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三类,粒度规格大多为100-150目.碱性氧化铝（pH9—10)：适用于碱性物质（如胺、生物碱)和对酸敏感(de)样品（如缩醛、糖苷等),也适用于烃类、甾体化合物等中性物质(de)分离.但这种吸附剂能引起被吸附(de)醛、酮(de)缩合.酯和内酯(de)水解、醇羟基(de)脱水、乙酰糖(de)去乙酰化、维生素A和K等(de)破坏等不良副反应.所以,这些化合物不宜用碱性氧化铝分离.酸性氧化铝（—：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物(de)分离.中性氧化铝（pH7—：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定(de)物质如酯、内酯等(de)分离,也可以用来分离弱(de)有机酸和碱等.（2)硅胶：硅胶是硅酸(de)部分脱水后(de)产物,其成分是SiO2·xH2O,又叫缩水硅酸.柱色谱用硅胶一般不含粘合剂.适用范围：非极性和极性化合物,适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸,及一系列合成产品如有机金属化合物等.（3)聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺)和锦纶66（聚己二酰己二胺)两种,分子量一般在16000～20000,其亲水性和亲脂性均较好,因此既可分离水溶性成份,也可分离脂溶性成分.可溶于浓盐酸、甲酸及热(de)乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定,对强酸可水解.聚酰胺色谱(de)原理：兼具吸附色谱和分配色谱(de)功能.采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱.分离对象：能与聚酰胺形成氢键(de)化合物,如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基(de)化合物及腈和醛等类化合物.聚酰胺在水中吸附能力(de)规律：形成氢键(de)基团(如酚经基、按基、酪基、硝基等)越多,吸附力越强.如丁二酸＞丁酸形成氢键(de)位置与吸附力有很大关系.对位、间位酚羟基使吸附力增大,邻位使吸附力减小.芳香核、共轭双键多者吸附力大,少者吸附力小.若形成分子内氢键,则使化合物(de)吸附力减小.（4)硅酸镁：中性硅酸镁(de)吸附特性介于氧化铝和硅胶之间,主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物.为了得到中性硅酸镁,用前先用稀盐酸,然后用醋酸洗涤,最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性.3、选洗脱剂：一般淋洗剂是采用TLC分析得到(de)展开剂(de)比例再稀释一倍后(de)溶剂.要使所需点在Rf值在左右(de)比较好.极性小(de)用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大(de)用甲醇：氯仿系统；极性大(de)用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统.常用溶剂(de)极性顺序：石油醚<环己烷/己烷<苯乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水.单一溶剂(de)极性大小顺序为：石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<吡啶<乙酸二氯甲烷也有用(de),但是要知道,它和硅胶(de)吸附是一个放热过程,所以夏天(de)时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷(de)时候会好一些.甲醇据说能溶解部分(de)硅胶,所以产品如果想过元素分析(de)话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等.一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性(de)体积比为1/3(de)混合溶剂.拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸.乙酸乙酯/石油醚=4:1可用TLC 分开.乙酸乙酯和石油醚(60-90).混合溶剂(de)极性顺序：苯∶氯仿(1+1)、环己烷∶乙酸乙酯(8+2)、氯仿∶丙酮(95+5)、苯∶丙酮(9+1)、苯∶乙酸乙酯(8+2)、氯仿∶乙醚(9+1)、苯∶甲醇(95+5)、苯∶乙醚(6+4)、环己烷∶乙酸乙酯(1+1)、氯仿∶乙醚(8+2)、氯仿∶甲醇(99+1)、苯∶甲醇(9+1)、氯仿∶丙酮(85+15)、苯∶乙醚(4+6)、苯∶乙酸乙酯(1+1)、氯仿∶甲醇(95+5)、氯仿∶丙酮(7+3)、苯∶乙酸乙酯(3+7)、苯∶乙醚(1+9)、乙醚∶甲醇(99+1)、乙酸乙酯∶甲醇(99+1)、苯∶丙酮(1+1)、氯仿∶甲醇(9+1)4、装柱：、湿装法：方法一：准确加入一定体积(de)溶剂,然后缓慢加入吸附剂,必要时可轻敲柱壁,排除多余溶剂,计算主留体积方法二：1) 搅成匀浆：先把硅胶泡在烧杯中,用干硅胶体积一倍(de)溶剂泡,用超声波超半个小时,中间看到气泡时用玻璃棒搅一下.如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌.如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱(de)话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥.氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%(de)醇.如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱.2) 装柱：用溶剂把柱子饱和一次.因为溶剂和硅胶饱和时放出(de)热量可能使产品分解.将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内.随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中.、干装法：在下端减压抽气(de)同时,将吸附剂通过长径漏斗缓缓到入柱内.装柱时一定要保证无气泡,同时敲打柱体使柱体更均匀紧凑,装毕,用洗脱液冲三次.柱子下面(de)活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中(de),可以采用四氟节门(de).装完(de)柱子应该要适度(de)紧密(太密了淋洗剂走(de)太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来).柱子更忌讳(de)是开裂,无论竖(de)还是横(de)都会影响分离效果,甚至作废5、压实：沉降完成后,加入更多(de)石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定.柱床约被压缩至9/10体积.无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂.6、上样：干法湿法都可以.海沙是没必要(de).1) 在硅胶上层加少量无水硫酸钠(以免样品被洗脱剂冲散).将样品溶于合适(de)溶剂后,在搅拌下加入样品量3～5倍(de)吸附剂,晾干至粉末状.然后在不扰动吸附剂层面(de)情况下,加到柱体上面.上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面.然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面.2) 将样品溶于合适(de)溶剂,在不扰动吸附剂层面(de)情况下,加到柱体上面.最后再用少量清洁溶剂对主壁洗涤2～3次,加完后将下面(de)活塞打开.待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量(de)低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色(de)了.加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品(de)溶剂和样品层有一段距离(2～4cm),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行. 7、过柱和收集：必须注意在洗脱(de)过程中,尤其是开始阶段,不能扰动层面.洗脱速度一般为每分钟流出1/200柱留体积左右.柱层析实际上是在扩散和分离之间(de)权衡.太低(de)洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱.梯度洗脱需注意标记不同溶剂(de)分界管号.分部收集：一般每管收集1/20～1/10柱留体积.收集(de)例子：10 mg上样量,1 g硅胶, ml收一馏分；1-2 g上样量,50 g硅胶(200-300目),20-50 ml收一馏分.8、检测：要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外(de)灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级.9、送谱：收集(de)产品旋干,在送谱前通常需要重结晶.如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前(de)最后纯化手段.可除去氢谱 ppm 左右所谓(de)“硅胶”峰.。
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检测器
五、高效液相层析
• 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 • 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 • 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 • 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、
甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等
五、高效液相层析
• 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 • 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，
高压泵、进样装置、色谱柱、检测器
HPLC的特点 1.高压 2.高速 3.高效 4.高灵敏度
三、层析技术原理
• 层析系统由两相组成： 一是固定相，另一是流动相 • 流动相：携带流过整个系
统的流体 • 固定相：静止不动的一相
三、层析技术原理
• 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份 的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶 解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离
• 吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是 固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别 而分离。
• 分配层析(partition chromatography)：固定相为液体， 利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。
• 离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以 具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流 动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合 物的一种方法。
• 若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 最终达到分离各组分的目的。
四、层析技术分类
毛细管电泳
气相层析法
超临界层析 法
吸附层析 法
正相分配层析 法
层析 法
分配层析
柱层析法
法
（高效液相层
析）
反相分配层析 法
凝胶渗透层析法
液相层析
薄层层析 法
纸分配层析 法
离子交换层析法 亲和层析法
其他
四、层析技术分类
• 以上各种层析法常应用于柱层析 (column chromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一 个方向移动而达到分离。
离子交换层析原理示意图
免疫亲和层析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ疫亲和层析
五、高效液相层析
• 高效液相层析（High performance liquid chromatography，HPLC）
• 一次进样检测20～50种氨基酸，不需要更换体系，自动 完成
• 仪器基本结构及原理同普通HPLC相似，针对氨基酸分析 细节优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯 度及柱温梯度控制等
1931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60多种色素 1938年，从VB中分离B6,出色的研究获得1938年诺贝尔化学奖
1941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液 即分配色谱法
-预测并实现气相色谱技术，1952年将色谱技术原理应用到分离
气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离
第一节 体液氨基酸测定
一、氨基酸测定方法概述 氨基酸检测方法主要有筛查试验和定量试验 纸层析和薄层层析法用于氨基酸分析鉴定 离子交换法常用于氨基酸的分离、定量测定 全自动氨基酸分析仪应用，可对各种体液中 氨基酸进行测定 特异性强灵敏度高的酶法及HPLC
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1．氨基酸自动分析仪
• 采用离子交换层析方式，对蛋白质水解液及各种游离氨 基酸的组分含量进行分析
• 在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术 • 由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输
送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱 • 高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检
测系统、数据系统等组成。
储液器
高效液相分析仪结构示意图
馏分装置
数据处理系统
输液泵
选择装置
层析柱
层析技术概述
检
测
器
的
响
应
R
进 样
1
进
峰
样
a
峰 基线
b
2
进
样
峰
3
h
tRa tR1
tR2 tR3
图30-1 色谱图
时间t(min)
层析技术概述
• 因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品 量少、结果准确等特点
• 适合于标本含量少,杂质含量多样品分析 • 尤其适用于生物样品的分离分析 • 层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析
方法，是生命科学、医学实验技术等研究领域必不可少 的手段和工具。
二、层析技术发展史
1903年，俄国植物学家茨维特 -将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形 -抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱 -石油醚洗涤柱子上→下：叶绿素b,a,叶黄素，胡萝卜素 -混合物的不同组分得到了分离 -得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法
四、层析技术分类
• 凝胶层析（gel chromatography）：固定相为多孔性凝胶， 利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程 度不同而得到分离。
• 亲和层析(affinity chromatography)：利用待分离物质 和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离， 如免疫亲和层析。
与正相正好相反 • 反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和
多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分 析、甾体化合物的分析
五、高效液相层析
反相层析最为常用，优点： • 反相层析用流动相的价格比正相层析便宜 • 对操作环境的污染较小 • 非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快 • 梯度洗脱的柱子更易于“再生”
-20世纪60年代，普通色 谱法已经不能满足人们对 生物成分分析测试的要求
-高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
高效液相色谱法 又称高压 高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色 谱的基础上发展起来的分析技术。
特别适用于高沸点、 不能气化或热稳定性 差的有机物分离分析， 生物化学与分子生物 学中的应用日益广泛。
④ ③② ①
层析法进行时有两个相 固定相（支持物），流动相（含待分离物质）。
固定相-碳酸钙
流动相-石油醚
这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之 后20多年，无人关注这一伟大发明
Michael Tswett (1872 - 1919), the inventor of the method of column chromatography