无菌室操作规程2018.6.16

无菌室操作规程

目录

一、准备工作 (1)

1 器具清洗 (1)

1.1 玻璃器皿 (1)

1.2 钢瓶 (2)

1.3 注射器 (2)

1.4 其他物品 (2)

2 用具包封及灭菌 (2)

二、试剂及培养基配制 (3)

1 生理盐水溶液 (3)

2 液体培养基 (3)

3 固体培养基 (4)

3.1 制作斜面培养基 (4)

3.2 制作平板培养基 (4)

三、无菌室环境卫生 (4)

1 日常管理工作 (4)

1.1 常规消毒 (4)

1.2 大消毒 (5)

1.3 无菌室沉降菌检测 (5)

2 操作规范 (5)

2.1 物品进入无菌室 (5)

2.2 人员进入无菌室 (6)

2.3 无菌室内操作 (6)

2.4 操作后处理 (7)

一、准备工作

1器具清洗

1.1 玻璃器皿

试管、离心管、三角瓶、平皿等玻璃器皿使用过后（带培养物），煮沸30 min，或直接高压蒸汽灭菌，倒出内容物后，然后用洗涤剂，流水冲洗至无泡沫，最后用蒸馏水冲洗3次，烘干。

新购玻璃器皿（如平皿，试管，茄瓶等）用1%~2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用洗涤剂洗刷，流水冲洗至无泡沫，再用蒸馏水冲洗，烘干。

1.2钢瓶

用流水冲刷三四次后，用1%碱水浸泡24h，倒出内容物后，然后用流水冲洗，最后用酒精冲洗，90-100℃烘干。

1.3注射器

用流水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次，烘干，下次使用前高压蒸汽灭菌或用75%酒精浸泡，下次使用前用火焰灼烧。

1.4 其他物品

无菌衣、帽子、口罩、酒纱、包封用纱布、拖布等其他物品，在每次用完后，用水洗涤洁净后，口罩、拖布用肥皂洗涤，晾干或烘干。无菌衣，纱布使用前用牛皮纸包好高压蒸汽灭菌。

2 用具包封及灭菌

2.1 刻度吸管

包扎前吸管的粗头应先塞少许普通棉花，以避免使用时将菌液吸入口中，或将口中内容物吹入培养液中。塞入的棉花应与吸管口保持5mm左右距离，若距离太近，容易被唾液浸湿，造成通气不良。一般这段棉花全长不得短于10mm。塞好棉花的吸管要用报纸包装。将

报纸裁为宽5-8cm的长条，先把试管尖端放在纸条一端，呈45°角折叠纸条，包住尖端，一手捏住管身，一手将试管压紧在桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后将剩余纸条打结，高压蒸汽灭菌。

2.2 接种针（茄瓶用）

报纸包扎，方法同吸管。

2.3 平皿：每10只平皿用2层报纸包封。

2.4 注射器及适配针头各部件

洗涤洁净的注射器及适配针头各部件用纱布一层层包好，用牛皮纸包封。高压蒸汽灭菌。

2.5 甘油管

根据需要准备干净的甘油管及配套的甘油盒，将甘油管螺旋盖拧紧后回拧半圈，放入烧杯中，用9层纱布封好，用牛皮纸包封。高压蒸汽灭菌121℃，1h。

2.6 试管、三角瓶等：管（瓶）口，依次用棉塞/纱布和牛皮纸包封。

2.7 棉塞、纱布：用牛皮纸包封。

2.8 无菌衣、裤

用牛皮纸包封好。

2.9 灭菌

将以上包封好的用具进行蒸汽灭菌，121 ℃、1h。物品灭菌完毕，器具放置于烘箱内90-100 ℃、1-2 h烘干，吸管，无菌衣等放入洁净区备用。

2.10 无菌物品放置

无菌物品必须保存在无菌包内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分开放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用，凡已取出的无菌物品均需再次消毒后使用。

二、试剂及培养基配制

1 生理盐水溶液

0.85%生理盐水溶液。

2 液体培养基

不同品种，按实际用量计算后，按配比称取各种试剂放入烧杯中（注：牛肉膏、酵母膏、麦芽浸膏等黏稠状药品，可用平皿称好后，热水溶解再倒入烧杯中；蛋白胨极易吸潮，称量时要迅速），加热溶解，并定容至配制体积，调pH值至标准范围，分装于三角瓶，塞上合适的棉塞，包封，灭菌。

3 固体培养基

液体培养基，调好pH值，加琼脂2.0%，加热溶解，分装——按要求，可分装于试管、茄瓶或三角瓶内，分装时需用漏斗，以免培养基粘附管口或瓶口浸湿污染棉塞，塞上合适的棉塞，包封，灭菌。3.1 制作斜面培养基

趁热将培养基分装于试管或茄瓶中，塞上合适的试管塞，包封，灭菌。待冷却至不烫手，摆斜面，长度——不超过试管（或茄瓶）长度的2/3，自然冷却凝固后，保藏待用。

3.2 制作平板培养基

将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入20~25 mL，以铺满皿底为度，轻晃混匀，平放至凝固，5个培养皿一叠，倒置于37 ℃环境中空白培养1天，以蒸发多余的水分，配制的培养基应在冰箱内保存，一般不得超过2周。

三、无菌室环境卫生

1 日常管理工作

1.1 常规消毒

每次无菌操作前，通无菌空气，并开启紫外灯杀菌30 min，超净台空气过滤器自净30 min，关闭无菌空气；每次操作时，先用75%酒精处理工作台面，再进行无菌操作；每次操作完毕后，75%酒精擦拭超净台台面，用0.2%新洁尔灭溶液拖地，并用75%酒精喷雾消毒，开紫外灯杀菌30 min以上，待下次使用时提前打开排风装置，方可进入操作。

1.2 大消毒

彻底清洁消毒——用0.2%新洁尔灭溶液或2%甲酚皂或75%酒精等消毒液擦地、墙、台面、灯，顺序是从上而下，从左到右，由里而外，不留任何死角，清洁完毕开启紫外灯照射1~2 h，每月进行一次沉降菌检测，如不合格，则重新清洁消毒处理。（消毒频率根据生产安排而定）

1.3 无菌室沉降菌检测

紫外灯关闭后半小时后，进入无菌室立即将营养琼脂平皿打开，在空气中放置30 min~120 min（每个房间各放置3~5个，分别放置工作位置的左中右等处），倒置于35~37℃培养箱培养48 h，取出检查，填写《菌种室沉降菌检测记录》。100级洁净区平板平均菌落数不得超过1个，10000级洁净区平均菌落数不得超过3个。如菌落数超标，应对无菌室重新进行彻底清洁消毒，直至重复检查符合要求为止。

甲醛熏蒸方法：将房间面积计算出，然后按照按照甲醛（40%）5mL/m3、高锰酸钾2.5g/m3的用量。不同情况下，用量有所不同，但比例均为2：1；将高锰酸钾放置于玻璃器皿中，然后将甲醛倒入器皿内快速撤离，关好房门。将空间密闭12 h后打开无菌风通风换气，熏蒸后若甲醛味浓烈，可在使用前用一半甲醛量的氨水中和。

2 操作规范

2.1 物品进入无菌室

每次操作前，将所需要带入无菌室内的所有物品，提前放入缓冲间（或传递窗）进行辐照灭菌后，方可带入；操作用无菌衣、口罩不得带出无菌室（灭菌除外）。

2.2 人员进入无菌室

进入无菌室前，操作人员按肥皂洗手、消毒液洗手、换无菌衣、裤、口罩、换工作鞋，然后消毒液洗手。通过缓冲间进入无菌室，进入的整个过程均要随手关门且需轻关轻开。

2.3 无菌室内操作

2.3.1 进入无菌室后，操作时，用75%酒精擦拭工作台面、双手，特殊情况下所用接种针、注射器等工具要进行火焰灼烧灭菌，整个操作过程均不要远离酒精灯火焰。

2.3.2 具体操作

2.3.2.1 接种斜面、茄瓶

甘油管保藏的菌种接种斜面或茄瓶：副操作持甘油管，75%酒精擦拭管身，配合主操作；主操作持空白斜面或茄瓶，打开塞前先用酒精擦拭管口和管身，经过火焰灼烧管口，旋开塞（注：保持塞子的无菌状态），用无菌接种针沾取甘油管内菌种，划蛇形线，塞子经火焰消毒后塞回，封好瓶口，一定温度培养一定时间。

2.3.2.2 液体种子制备

茄瓶斜面接种：副操作持生理盐水三角瓶，75%酒精擦拭瓶身，火焰消毒瓶口，将塞子旋开（注：保持塞子的无菌状态），配合主操作；主操作持菌种斜面，75%酒精擦拭管身，旋开塞子（注：保持塞子的无菌状态），移液管移入生理盐水20 mL，并用移液管将菌层刮

下（注：移液管不得碰茄瓶口），然后将菌悬液悬空注入生理盐水三角瓶，副操作将塞子经火焰消毒后塞回，摇匀，封好瓶口，送发酵，主操作平板划线法或摇瓶发酵进行无菌跟踪。

2.3.2.3 菌种分纯

**每月分纯一次，**菌株根据使用情况而定。分纯方法为稀释涂布法。利用甘油管直接分纯或活化一代斜面分纯。

2.3.2.4 摇瓶小试

根据生产需要更新更换的原材物料，摇瓶验证及梯度实验，选出适合的最佳原材料。

2.3.3 每次操作完成后将废弃物带出无菌室，并用专用拖布沾取0.2%新洁尔灭溶液拖地，然后用75%的酒精喷雾消毒，从里到外，包括无菌室、培养间、内外缓冲间。

2.4 操作后处理

2.4.1 对于摇床间内培养过程出现的异常瓶需立即取下，并在高压蒸汽灭菌锅内灭菌洗刷干净，用酸或碱液浸泡后，单独存放备用。

2.4.2 将使用过的接种环及移液管、封口纱布、三角巾、酒纱等物品清洗干净，并灭菌以备下次使用。

2.4.3 对于常用的封口纱布、塞子有污染物的及时清理干净，塞子下次使用前需要进行一次彻底灭菌。

2.4.4 实验用吸管、接种针等工具物品清洗干净，灭菌后放烘箱内烘干。

2.4.5 每次操作后对洁净区进行彻底的清洁，然后喷雾消毒，各类消毒液（0.2%新洁尔灭、2%甲酚皂、75%酒精等）交替使用。