第十章 基因组学与系统毒理学

2Gy γ射线照射 射线照射AHH-1细胞后和对照组细胞基因表达的芯片杂交图谱 射线照射 细胞后和对照组细胞基因表达的芯片杂交图谱
图1-3 照射后 AHH-1细胞与对照组细胞基因表达芯片结果的散点图比较 细胞与对照组细胞基因表达芯片结果的散点图比较
10Gy γ射线照射 射线照射AHH-1细胞后和对照组细胞基因表达的芯片杂交图谱 射线照射 细胞后和对照组细胞基因表达的芯片杂交图谱
第十章 毒理基因组学与系统毒理学
湘南学院预防检验系 邓 暑 芳
第一节 概
述
毒理基因组学(toxicogenomics)是研究生物体的整个基因组 如何对环境有害因素发生反应的一门新兴学科。 毒理学研究涉及的环境有害因素包括化学因素(化学物、混 合化学物等)、物理因素(电离与非电离辐射、噪声、异常气 温等)和生物因素(细菌、病毒等)。 研究基因组如何对化学毒物发生反应的学科称为毒理基因组 学。 随着人类基因组计划(HGP)的顺利进行，生物医学研究已进 入后基因组时代(post-genome era)。基因组学的研究发生了 深刻的变化，已从结构基因组学(structural genomics)过渡 到功能基因组学(functional genomics)。
10Gy γ照射后 AHH-1细胞与对照组细胞基因表达芯片结果的散点图比较 照射后 细胞与对照组细胞基因表达芯片结果的散点图比较
(四)RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技术 RNA干涉是近年来发展的一种基因功能研究的方法，能快 速有效地沉寂靶基因的表达，进而从反向角度来阐明基因的 功能。RNAi是指将外源性双链RNA(double-stranded RNA， dsRNA)导人细胞后，可产生21～23nt长度的小分子干涉 RNA(small interference RNA，siRNA)，引起与其序列同源 的特异基因mRNA降解的现象，属于转录后的基因沉默 (post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 在哺乳动物细胞中进行RNAi实验包括5个步骤：选取目的 基因；设计相应的siRNA序列；制备siRNA；siRNA转染哺 乳动物细胞；RNAi效果分析。其中，靶siRNA序列选择是 RNAi实验成败的关键。
微阵列技术的应用可增加对化学物毒作用的 检测效率和敏感性，其水平可与Northern分 析相似，且数据的变异范围小于动物之间的 个体差异。理论上，该项技术将有可能检测 一种特定的化学物对全部人类基因组的效应。 而且微阵列的方法就像流水线作业，可同时 对多个化学物的多基因效应进行检测。
主要的国际性合作性机构： 国际生命科学研究院(ILSI)基因组学委员会于1999年成立 了第一个合作研究机构，对肝脏毒物、肾脏毒物和遗传毒 物进行了国际合作研究。 美国环境卫生科学研究所(NIEHS)于2000年建立了一个国 家毒理基因组学中心(National Center for Toxicogenomics， NCT)，主要任务有： ①促进基因和蛋白表达技术在毒理学中的应用； ②促进人类环境暴露和疾病易感性关系的研究； ③确定暴露和毒效应的生物标志； ④推进暴露与生物学反应关系的计算和处理方法； ⑤建立毒理基因组学的公用数据库。2003年，又成立了代 谢组学技术合作组织。
基因表达序列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)技术的主要理论依据是：来自 cDNA 3’端特定位置的一段9～11bp长的序列能够区 分基因组中95％的基因。这一段基因特异的序列被 称为标签(SAGEtag)。通过对cDNA制备SAGE标签 并将这些标签串联起来，然后对其进行测定，不仅 可以显示各SAGE所代表的基因在特定组织中是否 表达，而且还可以根据各SAGE标签所出现的频率 作为其所代表的基因表达丰度的指标。 应用SAGE技术的一个前提条件是GenBank中必须 有足够的某一物种的DNA序列信息，尤其是表达序 列标签(expressed sequence tag，EST)的序列资 料。
基因表达的测定，是先将受试动物染毒，其靶器官或 细胞与毒物接触后，发生反应或被活化的基因会产生 mRNA。然后将这些mRNA用核素或荧光色素标记后， 加入基因芯片。在一个单个的阵列中加入两种标记样 品进行杂交。杂交完成后，可用图像解析显微镜或激 光扫描显微镜进行探测和分析。根据发生的结合反应 的情况，便可以判断是哪些基因发生了改变。 通常采用发红色荧光的Cy3和发绿色荧光的Cy5荧光 色素，分别标记实验和对照样品中的RNAs。由于荧 光的强度和RNAs的含量间有一定的相关关系，可通 过两种荧光的相对强度变化来确定实验组样品中DNA 表达的差异。如果再与实时PCR相结合，就可得到特 定基因的定量表达信息，发现新的致病基因或疾病相 关基因等多个研究领域。
(五)单核苷酸多态性检测 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的 DNA序列多态性，在人群中发生频率大于1％。SNPs有 单碱基的转换、颠换、插入、缺失等形式。 在基因组中搜索SNPs的最普遍方法是将已定位的序列标 签位点(sequence tagged sites，STS)和表达序列标签 (expressed sequence tags，EST)进行测序。 另外，DNA芯片技术的应用使得大规模发现和识别SNPs 的工作成为可能。 由于基因组非常庞大，在整个基因组的范围内检测所有 的SNPs并确定其功能在实际上非常困难。只通过检测其 中少数几个标志性的SNPs，识别出不同的单倍型，有助 于判断个体对化学物中毒易感性的差异。
毒理基因组学的研究目标包括近期目标和远期目标。 近期目标是确定某种有害因素的反应基因(信号基因) 用于毒理学和相关疾病的研究； 远期目标则是建立全基因组与蛋白质组毒性反应知 识库，并在此基础上开辟以芯片技术和生物信息技 术为特征的数字毒理学(digitized toxicology) 毒理基因组学的建立，为从传统的遗传毒性检测方 法到基因集群检测方法的转变提供了可能，同时将 显著提高遗传损伤的检测水平和降低检测的阈值。
二者的优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的 基因的表达进行对比分析。每一次测试结果，都可能得 到一系列显著性差异表达的基因。采用图像分析的方法， 可以确定哪些基因的改变与染毒处理有关，并具有剂量 依赖性或时间相关性。然后，通过文献发掘、数据库比 对和生物模型分析，可将生物体的适应性反应和毒性效 应加以区别，从而在基因表达的水平上，提供新的生物 学终点。 cDNA微阵列技术的主要优点是灵敏度高，mRNA丰 度低至10万分之一仍能被检测出。可同时采用几种不同 颜色的荧光染料标记探针，这样在同一张阵列膜上进行 一次杂交实验就可分析不同样品间基因表达的差异。 但是cDNA微阵列的主要不足是成本较高，需要特殊的 信号检测分析系统，玻片上的微阵列不能重复使用等。
第二节 毒理基因组学研究的技术平台
一、基因组学与转录组学技术平台 (一)差异显示反转录PCR技术 差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术是以分子生物学上应 用最广泛的两种技术-PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础。 其基本原理是：以1对细胞(或组织)的总RNA反转录而成的 cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5’端和3’端引物 的合理设计和组合，将细胞(或组织)中表达的约15000种基 因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞(或组织) 中表达有差异的cDNA片断。 优点：DDRT-PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需 RNA量少和重复性高等。 缺点：DDRT-PCR技术假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成 分不均一、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等。
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(三)微阵列分析 DNA微阵列(microarray assay)或DNA芯片(DNA chip)技术，是近年来发展起来的新的分子生物学研 究工具。研究所使用的基本硬件，是基因微阵列或 基因芯片，其上含有成千上万个寡聚核苷酸片段或 cDNA探针(cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸)。 这些探针按一定顺序以矩阵方式排列在载玻片大小 的塑料或玻璃板上，在lcm2的面积上可有1万～10 万个不同的排列，并可有多个拷贝，其敏感性可达 1～5个拷贝mRNA/细胞。
毒理基因组学的概念：最初的定义，是将基因组 学的理论和技术应用于毒理学，研究组织细胞特 定基因的功能并预测受试物毒性的学科。 目前：毒理基因组学研究不仅包括基因组水平的 效应，也包括基因的RNA表达(转录组学)、蛋白 产物表达(蛋白质组学)、代谢谱改变(代谢组学)、 遗传多态性以及生物信息学等相关领域的内容。 毒理基因组学的基本任务：利用人类基因组的资 料，帮助筛选和鉴别潜在的环境毒物，并在基因 组水平上阐明毒作用发生的机制。