生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学研究进展_戴家银
211036529_环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第1期2023年2月V ol.18,No.1Feb.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(22076179,21677142);福建省自然科学基金资助项目(2022J06033);厦门市青年创新基金资助项目(3502Z20206091)㊀㊀第一作者:李富萍(1997 ),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E -mail:***********.cn ㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220914003李富萍,黄清育.环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展[J].生态毒理学报,2023,18(1):1-15Li F P,Huang Q Y.Research progress on epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutants [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(1):1-15(in Chinese)环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展李富萍1,2,3,黄清育1,*1.中国科学院城市环境研究所,中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门3610212.中国科学院大学,北京1000493.福建农林大学生命科学学院,福州350028收稿日期:2022-09-14㊀㊀录用日期:2022-11-09摘要:表观遗传修饰与神经系统功能密切相关,其在环境污染物暴露致神经毒性中的作用机制已引起广泛关注㊂本文综述了重金属㊁有机污染物和空气颗粒物等典型环境污染物对人体和模式生物表观遗传修饰(DNA 甲基化㊁组蛋白修饰和ncRNA 等)和神经系统功能的影响,指出环境污染物可直接或(通过引起氧化胁迫)间接改变表观遗传修饰状态,导致相关基因表达失调,从而诱导一系列神经毒性,并提出当前研究存在的局限性㊂建议未来针对污染物的神经毒性机制研究,应着重关注组蛋白修饰和ncRNA 以及不同类型表观遗传修饰之间的交互作用;同时,环境污染物复合暴露导致神经毒性的表观遗传机制有待深入研究;如何从表观遗传角度解释环境污染物诱导神经毒性的年龄易感性及性别特异性也值得进一步探讨㊂关键词:环境污染物;表观遗传修饰;神经毒性;毒理机制文章编号:1673-5897(2023)1-001-15㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AResearch Progress on Epigenetic Mechanism of Neurotoxicity Induced by Environmental PollutantsLi Fuping 1,2,3,Huang Qingyu 1,*1.Key Laboratory of Urban Environment and Health,Institute of Urban Environment,Chinese Academy of Sciences,Xiamen 361021,China2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China3.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350028,ChinaReceived 14September 2022㊀㊀accepted 9November 2022Abstract :Studies have shown that environmental pollutants can enter the human body directly through drinking water,breathing,dermal contact or indirectly through the food chain,and can pose adverse effects on the central nervous system.Epigenetic modifications are closely related to the function of the nervous system,and their role in the neurotoxicity induced by environmental pollutant exposure has attracted much attention.This paper reviews the effects of typical environmental pollutants,such as heavy metals,organic pollutants and air particulate matters,on epigenetic modifications (DNA methylation,histone modifications,and ncRNAs)and neurological functions in hu -2㊀生态毒理学报第18卷mans and model organisms,and suggests that environmental pollutants can directly or indirectly (by causing oxida -tive stress)alter the status of epigenetic modifications,leading to dysregulation of relevant gene expression and thus inducing a series of neurotoxicity,such as neuronal apoptosis,learning and memory deficits and neurodegenerative diseases.The limitations of the current studies are also presented.It is suggested that future research on the neuro -toxicity mechanisms of pollutants should pay more attention to histone modifications and ncRNAs,as well as the corsstalk between different epigenetic modifications.In addition,the epigenetic mechanisms involved in the neuro -toxicity induced by combined exposure of various pollutants and the age susceptibility and sex specificity of neuro -toxicity also deserve further investigation.Keywords :environmental pollutants;epigenetic modifications;neurotoxicity;toxicological mechanisms ㊀㊀包括神经系统疾病在内的许多疾病都与环境因素密切相关㊂大量研究证实,暴露于环境污染物会导致神经炎症㊁氧化应激㊁线粒体功能障碍和神经元凋亡等,从而诱发一系列神经毒性和疾病㊂例如,大鼠长期暴露于铅(Pb)后,其海马中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子-α水平上升,同时慢性胶质细胞活化并伴有炎症和神经退行性特征[1]㊂斑马鱼在双酚A(BPA)处理后,焦虑和恐惧反应异常,而这些行为改变可能源于其中枢神经系统中参与抗氧化防御机制的基因表达失调[2]㊂此外,低剂量甲基汞可通过改变线粒体功能和引起mtDNA 的氧化损伤诱导人类神经祖细胞凋亡[3];而大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞(PC12)在经过Mn 3O 4纳米颗粒暴露后,细胞活力降低,并通过引发氧化应激诱导细胞发生凋亡[4]㊂一般认为,大多数环境污染物主要改变生物体的表观基因组而非直接改变其DNA 序列㊂表观遗传学是研究在不改变DNA 序列情况下的基因表达的可遗传变化,其研究对象是表观基因组㊂表观基因组相对于基因组而言,不仅序列包含遗传信息,同时它们的修饰也记载遗传信息㊂表观基因组记录生物体DNA 和组蛋白的一些改变或修饰,同时这些变化或修饰可以从亲本传给子代㊂表观遗传修饰包含DNA 甲基化(DNA methylation)㊁组蛋白修饰(his -tone modification)和非编码RNA (non -coding RNA,ncRNA)等,它们可以在外界环境的影响下改变基因组功能㊂DNA 甲基化是DNA 化学修饰的一种形式,指在DNA 甲基化转移酶(如Dnmt1㊁Dnmt2㊁Dnmt3a 和Dnmt3b 等)的作用下,将一个甲基加到胞嘧啶上,并转化为5-甲基胞嘧啶的一种修饰[5]㊂这一过程通常是发生在CpG 岛上,对生物的基因表达调控具有重要意义㊂DNA 甲基化参与调控许多细胞过程,包含染色质结构㊁染色质重塑㊁X 染色体失活㊁基因组印记㊁染色体稳定性以及基因转录等等㊂一般情况下,基因启动子的高甲基化通常被认为可导致该基因的表达水平降低㊂相反,基因启动子的低甲基化则可激活基因表达㊂组蛋白修饰主要是指发生在核心组蛋白N 端氨基酸残基上的甲基化㊁乙酰化㊁磷酸化和泛素化等共价修饰[6]㊂组蛋白修饰可以通过影响相邻核小体中不同组蛋白的接触或组蛋白与DNA 的相互作用影响高阶染色质结构,使之变得松散或紧密,从而影响基因的转录水平[7]㊂其中,组蛋白高乙酰化能够使染色质结构变松散,与转录激活有关㊂组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的作用维持了组蛋白乙酰化的动态平衡㊂但当外界环境发生改变时,这种稳态便会被破坏,从而使基因表达水平发生变化㊂组蛋白甲基化则是另一种重要的组蛋白修饰,在基因表达中同时具有激活和抑制的作用㊂组蛋白中不同位点赖氨酸残基上发生的甲基化具有不同的生物学功能㊂比如,组蛋白H3K9的甲基化通常导致基因沉默,而H3K4甲基化则与基因表达激活有关[8]㊂非编码RNA 也在基因表达调控中发挥重要作用㊂根据非编码RNA 的大小可以分为长链非编码RNA(lncRNA)和短链非编码RNA(sncRNA),常见的短链非编码RNA 包括小干扰RNA (siRNA)㊁微小RNA(miRNA)等[9]㊂其中miRNA 可通过导致靶标mRNA 的降解或翻译沉默调控基因表达,因而一般可使基因表达沉默㊂大多数人类中枢神经系统疾病都与表观基因组的扰动有关[10]㊂表观遗传修饰最典型的作用主要表现在神经细胞命运决定㊁突触㊁神经网络连接和可塑性以及跨代遗传等㊂例如,有研究表明,缺乏Dnmt1和Dnmt3a 的小鼠DNA 甲基化水平降低,海马CA1区域的可塑性发生改变,导致学习记忆功能受损[11]㊂第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展3㊀死亡域相关蛋白是一组组蛋白伴侣,它通过促进H3.3加载和转录结合到神经元基因相关的染色质中响应神经元去极化,从而导致基因转录激活[12]㊂miRNAs㊁Piwi互作RNA(piRNAs)和lncRNA都参与调节突触的形成和功能㊂miR-339-5p靶向调节BACE1,导致BACE1在阿尔茨海默症(AD)患者脑中的表达水平降低[13]㊂此外,许多研究已经聚焦于不同的表观遗传因子如何协调神经干细胞的自我更新和维持㊁谱系限制及神经元和胶质成熟等方面[14]㊂目前关于环境污染物诱导神经毒性的机制研究也逐渐深入㊂随着表观遗传学研究技术的不断发展,表观遗传修饰在环境污染物暴露导致神经毒性中的作用机制研究日益受到重视[15-16]㊂本文主要综述了典型环境污染物(金属㊁有机污染物和空气颗粒物等)暴露诱导神经系统毒性的表观遗传学机制(DNA甲基化㊁组蛋白修饰和非编码RNA)相关研究㊂1㊀环境污染物暴露诱导神经毒性的表观遗传机制(Epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutants exposure)1.1㊀重金属1.1.1㊀铝(Al)有研究探讨了Al电解工人认知功能与DNA 甲基化的关系㊂结果表明,简易精神状态检查得分和全基因组DNA甲基化水平随血清Al浓度的升高而降低,轻度认知障碍(MCI)发病风险增加,并且MCI与DNA甲基化显著负相关[17]㊂另一项研究表明,淀粉样前体蛋白(APP)基因启动子DNA甲基化水平的降低可能与工人血清Al水平的升高有关[18]㊂此外,在动物模型中也有相同的发现,雄性大鼠暴露于AlCl3后,海马组织中APP启动子DNA甲基化水平降低,APP㊁Aβ含量升高[19],从而增加AD患病风险㊂小鼠在AlCl3暴露后,海马中MBDs㊁DnMTs 和MeCPb表达水平降低导致APP基因的低甲基化和Aβ沉积[20],成为AD发展的潜在风险因素㊂报道显示,大鼠暴露于麦芽酸铝后,脑组织的全基因组DNA甲基化水平降低,并导致学习记忆功能障碍[21]㊂组蛋白修饰也与Al诱导的神经毒性密切相关㊂有研究表明,职业Al暴露可通过提高组蛋白H3的甲基化修饰(尤其H3K27me3和H3K9me2)水平,抑制学习记忆相关蛋白BDNF和EGR1的表达,从而影响学习记忆功能[22]㊂此外,Al暴露可上调组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的表达,下调BDNF启动子的H3K9和H4K12乙酰化,最终抑制BDNF表达,导致大鼠空间学习记忆能力减弱[23]㊂低强度脉冲超声(LIPUS)则可通过恢复组蛋白乙酰化和BDNF表达,使受损的认知功能得到改善[23]㊂1.1.2㊀砷(As)As暴露和表观遗传修饰之间的一个可能联系在于其生物转化,即通过共用染色质重塑所需的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)对DNA甲基化产生影响[24]㊂随着大鼠脑皮质和海马组织中总As浓度增加,DNA甲基转移酶(DNMTs)和去甲基化酶(TETs)表达下调,导致脑组织中DNA甲基化/去甲基化过程显著受到抑制,且这种变化呈剂量依赖性[25]㊂同时,As可以破坏氧化/抗氧化平衡,并通过TCA循环和α-酮戊二酸(α-KG)途径进一步抑制TETs的表达,从而导致DNA 甲基化/去甲基化破坏,诱导大鼠学习记忆功能损伤[25]㊂发育阶段暴露于低水平As可导致组蛋白H3K9ac和H3K4me3在成年雌性小鼠中水平下降,但在雄性小鼠中上升,最终导致小鼠齿状回海马神经发生障碍,并出现抑郁样症状[26]㊂母鼠在妊娠期持续As暴露后,子代小鼠的空间㊁情景记忆功能受到损害,这可能是由于小鼠皮质和海马组织H3K9的低乙酰化[27]㊂流行病学调查和实验研究表明,miRNA在As 暴露中也发挥着重要作用,同时可能对认知功能产生影响㊂As可通过上调miR-219,靶向降低CaMK Ⅱ水平,诱导学习和记忆障碍[28]㊂同时NMDA受体亚基2(NR2)和记忆相关蛋白c-Fos和c-Jun可通过抑制miR-219而上调,从而改善As诱导的海马结构损害和学习记忆损伤[28]㊂1.1.3㊀锰(Mn)有研究测定了201名电焊工人血液中的NOS2外显子1的DNA甲基化水平,发现该位点的低甲基化促进了该基因的表达,从而诱导神经炎症的发生,增加帕金森病(PD)的发病风险[29]㊂人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)经慢性Mn暴露后,Parkin和PINK1这2个基因均发生高甲基化,基因活性降低,也可能加剧PD发病风险[30]㊂酪氨酸羟化酶(TH)在多巴胺的生物合成中起着至关重要的作用㊂Mn暴露可导致TH的DNA甲基化水平升高,基因表达水平下降,从而抑制多巴胺生物合成[30]㊂此外,SH-4㊀生态毒理学报第18卷SY5Y细胞在慢性Mn暴露后,通过诱导高甲基化下调了PINK1-PARK2表达,表明Mn可能通过表观遗传调控导致神经细胞线粒体功能障碍[30]㊂由于表观遗传修饰变化是可遗传的,小鼠在Mn暴露后,其子代海马中一些参与分化过程的基因如Mid1㊁Nr2f1和Atp1a3等发生高甲基化,致使多巴胺能中间神经元数量减少,海马神经发生持续中断[31]㊂还有研究表明,产前Mn暴露可能通过表观遗传机制影响胎儿神经发育㊂分析胎盘的全基因组甲基化,发现713个CpG位点甲基化与Mn暴露有关,其中5个差异甲基化位点位于神经发育相关基因中[32]㊂PC12和SH-SY5Y细胞暴露于MnCl2后, HDAC3和HDAC4表达水平显著增加,同时HAT 水平下降,导致H3和H4乙酰化水平下调,从而诱导细胞凋亡,而HAT抑制剂处理后则可以缓解Mn 诱导的细胞活力下降以及凋亡[33]㊂1.1.4㊀铅(Pb)研究发现,雌性小鼠在孕前㊁孕中和哺乳期持续Pb暴露后,其子代小鼠海马体中MECP2水平显著下降,DNMT1水平显著增加,同时在皮质中发现DNMT1㊁DNMT3a和MECP2的表达显著增加,此外,子代雌鼠皮质中的糖皮质激素受体基因(Nr3c1)甲基化也发生显著改变,这可能会给小鼠海马和皮质功能以及认知功能造成不利影响[34]㊂有趣的是,围产期Pb暴露与出生后早期Pb暴露对小鼠海马中DNA甲基化相关酶的影响有所不同㊂与对照组相比,Dnmt1只有在出生后早期Pb暴露的雄鼠存在显著差异,Dnmt3a在围产期暴露雄鼠和出生后早期暴露雌鼠都显著降低,雌鼠MeCP2表达水平显著降低,可能会导致多种认知障碍疾病[35]㊂此外,Pb暴露还可能通过DNA高甲基化下调神经分化相关基因表达,从而促进神经退行性过程[36]㊂早期Pb暴露(出生1~21d)会导致DNMT1活性降低,改变参与AD通路的APP和β分泌酶1(bace1)基因的甲基化水平,导致APP的过表达,以及生命后期Aβ水平的增加,增加晚年AD发病风险[37]㊂小鼠早期Pb暴露后,大脑皮层中与基因激活相关的组蛋白H3K9ac和H3K4me2水平下降,而与基因活性抑制相关的H3K27me3蛋白水平上升[38],这可能增加神经退行性疾病的患病风险㊂靶向AD相关蛋白的miRNA也会受到Pb的影响㊂生命早期Pb暴露显著影响海马中6个靶向神经毒性蛋白的miRNA表达㊂其中,miR-106b(靶向APP mRNA)和miR-124(靶向SP1mRNA)减少,这可能会导致晚年神经毒性蛋白的过度表达,增加AD 的发病风险[39]㊂1.1.5㊀汞(Hg)有研究表明,产前Hg暴露水平与PON1基因的低甲基化水平相关,这可能导致了儿童期男孩的认知功能障碍[40]㊂除此之外,Hg暴露后,斑马鱼中长链非编码RNA Malat1可被特异性上调10倍以上,Malat1在斑马鱼胚胎的脑区㊁眼睛和脊索中高度表达,并改变神经发育相关基因表达模式,导致斑马鱼幼体的神经行为障碍[41]㊂由于大脑对甲基汞(MeHg)具有很强的亲和力,它可以通过中性氨基酸转运系统Ⅰ与L-半胱氨酸的复合体穿过血脑屏障并分布到大脑的各个区域[42],使大脑功能受到不同程度的损害㊂越来越多的研究表明,MeHg诱导的神经系统疾病与DNA甲基化有关㊂大鼠胚胎皮质神经干细胞(NSCs)暴露于低剂量MeHg后,整体DNA甲基化水平下降,细胞周期调节因子p16和p21表达上升,导致细胞周期阻滞,并且这些变化在无MeHg暴露的传代细胞中也可观察到[43]㊂胎儿脑源性永生细胞(LUHMES)暴露于MeHg 后,TH基因启动子的组蛋白H3K27me3显著增加, TH水平降低,从而抑制多巴胺的生物合成[44]㊂此外,MeHg显著下调了小鼠海马中BDNF启动子的H3乙酰化并上调H3K27me3,同时DNA甲基化也显著上调,导致BDNF基因表达抑制,小鼠出现抑郁行为[45]㊂人类神经祖细胞ReNcell CX对MeHg高度敏感㊂研究结果显示,低剂量MeHg可通过降低miR-25的水平㊁上调p53以及线粒体发生相关基因的表达,进而可能损害细胞线粒体功能[46]㊂1.1.6㊀其他重金属铜(Cu)暴露与神经系统中DNA甲基化㊁组蛋白修饰之间的联系尚未被发现㊂但有研究发现,Cu暴露可能会导致某些miRNA水平的变化㊂miR-187㊁miR-128㊁miR-138㊁miR-183和miR-7a已经被证明在嗅觉系统中特异性表达,特别是miR-183家族成员在斑马鱼的神经感觉器官中大量表达㊂有研究结果显示,斑马鱼经Cu暴露后,其侧线嗅觉感觉细胞中miR-183表达水平显著下降,嗅觉上皮细胞凋亡增加,感觉神经元丢失,最终可能导致斑马鱼嗅觉障碍[47]㊂第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展5㊀镍(Ni)处理的原代培养海马神经元中可以观察到细胞树突的复杂性降低,同时组蛋白乙酰化受到了抑制[48]㊂此外,Ni暴露后的小鼠海马组织组蛋白低乙酰化,海马树突复杂性下降,并且学习记忆能力受损[48]㊂神经细胞(Neuro-2a)在Ni暴露下,miR-210过表达并导致ISCU1/2表达水平下调,miR-210抑制剂则可缓解Ni诱导的ISCU1/2下调[49]㊂ISCU1/2负责线粒体呼吸和能量产生[50],其表达下调可能影响细胞的线粒体功能㊂铅和镉联合暴露则通过上调组蛋白去乙酰化酶HDAC2表达,降低大鼠海马组织的组蛋白乙酰化水平,最终降低大鼠海马树突棘密度,损害大鼠的学习记忆能力[51]㊂1.2㊀有机物1.2.1㊀多环芳烃(PAHs)一项流行病学研究发现,产前PAHs暴露与LINE1DNA甲基化负相关,而LINE1甲基化与儿童智商显著正相关,但LINE1并未直接介导PAHs 暴露与智商之间的关联[52]㊂苯并(a)芘(B[a]P)是一种常见的PAHs㊂由于其亲脂性,B[a]P及其代谢产物可以穿过血脑屏障,到达脑组织,引起中枢神经系统损伤[53]㊂斑马鱼暴露于B[a]P后,DNA甲基转移酶表达普遍降低,整体DNA甲基化水平下降,斑马鱼现表出社会焦虑样行为,并且F2代成年斑马鱼也存在此现象[54],这可能与表观遗传修饰的跨代遗传有关㊂此外,B[a]P暴露后,大鼠海马中miRNA水平下降,而DNA甲基化和lncRNA水平显著上调,其中差异甲基化基因涉及通路大部分与学习记忆相关,最终导致大鼠的学习记忆功能障碍[55]㊂而小鼠暴露于B[a]P后,可通过DNA高甲基化下调NR2B[56]㊁BDNF[57]基因的转录水平,致使小鼠出现短期记忆缺陷㊁焦虑样行为及认知和行为障碍㊂在体外实验中也发现,海马神经元细胞HT22经B[a]P暴露后,BDNF基因启动子的DNA甲基化水平上升,基因转录水平下降,从而诱导细胞肿胀及炎症发生[57]㊂1.2.2㊀双酚A(BPA)有研究观察到,产前BPA暴露后,低APGAR (神经发育疾病风险增加的预测因子)与BPA诱导的Grin2b高甲基化有关[58]㊂此外,BPA暴露会导致雌性大鼠后代海马体中的BDNF基因启动子高度甲基化,下调其基因转录水平,从而影响大鼠的空间学习记忆功能[59]㊂另一研究发现,子代大鼠海马组织中的Fkbp5基因高甲基化也与母本BPA暴露有关,并因此对子代大鼠的应激反应产生不良影响[60]㊂围产期的小鼠暴露于BPA后,其子代雄鼠的空间记忆能力受到损伤,同时伴随着大脑皮质和海马的DNA甲基化减少以及组蛋白H3乙酰化增加[61]㊂氯化钾协同转运蛋白2(KCC2)参与维持细胞内氯化物的平衡,负责从成熟神经元中转运出氯化物[62]㊂有研究发现,经BPA暴露后,小鼠大脑皮层神经元中组蛋白乙酰化水平下降,Kcc2基因的表达受到了抑制和延迟,从而导致皮质神经网络受损[63]㊂1.2.3㊀农药Neuro-2a细胞用百草枯处理后,通过ROS上调DNA甲基化,降低与细胞增殖㊁迁移与凋亡相关的miR-17-5p表达水平,进而促进细胞凋亡[64]㊂此外, N27多巴胺能神经元细胞暴露于百草枯后,PKCδ蛋白水解增强,同时细胞中HDAC蛋白水平显著下降㊁组蛋白H3乙酰化增加[65]㊂PKCδ蛋白水解活化是细胞死亡的关键标志之一㊂因此,百草枯可通过提高组蛋白乙酰化水平,增强PKCδ水解活化,从而诱导神经元细胞凋亡[65]㊂研究表明,氯菊酯暴露导致斑马鱼整体游泳活动迟发性降低㊁焦虑,这可能是由于DNA高甲基化诱导的谷氨酸活性相关基因(如fmr1㊁pnocb等)的下调所导致,并且该表观遗传变化所导致的神经行为改变具有跨代遗传效应[66]㊂C57BL/6小鼠发育过程中暴露于狄氏剂,可导致其脑黑质中Nr4a2和Lmx1b等多巴胺能神经元发育相关基因的DNA甲基化水平改变,从而导致多巴胺能神经元进行性退化,增加PD发病风险[67]㊂组蛋白修饰在狄氏剂诱导的神经细胞死亡中发挥重要作用㊂中脑多巴胺能神经元细胞暴露于狄氏剂,可诱导组蛋白H3和H4的高度乙酰化,并导致cAMP反应元件结合蛋白的积累和蛋白激酶PKCδ的水解活化,进而促进细胞凋亡[68]㊂体外实验发现,分化前阿特拉津暴露会诱发SH-SY5Y细胞一系列的表型改变,例如突触数量以及长度发生变化,同时伴随着表观遗传基因组的变化,如DNA甲基化增加,H3K9me3和H3K27me3的减少㊂这些表观遗传修饰变化可能破坏了组成性异染色质的形成,并导致SNCA表达上调,增加PD 风险[69]㊂1.2.4㊀其他有机物多氯联苯暴露后,大鼠小脑和大脑皮层甲基化6㊀生态毒理学报第18卷水平下调,并诱导小脑和大脑皮层发生DNA 损伤[70]㊂SK -N -SH 细胞经全氟辛烷磺酸(PFOS)暴露后,BDNF 基因启动子的DNA 甲基化水平及miR -NA -16㊁miRNA -22和miRNA -30a -5p 均上升,BDNF转录水平下降,最终导致细胞缩小㊁活力下降[71]㊂另外,挥发性有机物(VOCs)复合暴露导致MALAT1lncRNA 显著减少,同时8个基因因DNA 超甲基化而显著下调,其中包含CNTNAP3㊁SULT4A1㊁CLIP2㊁CACNG8㊁WNT7B ㊁GLS2㊁TP73和FMR1等基因,这些基因的下调可能导致突触㊁树突棘的数量和密度降低,以及运动㊁学习记忆能力受损[72]㊂1.3㊀空气颗粒物少量研究表明,表观遗传调控在空气颗粒物暴露诱导的神经毒性中发挥重要作用㊂人体和动物模型研究发现,空气颗粒物暴露引起的脑组织中H3K9me2/3降低可能导致基因组不稳定㊁DNA 损伤及APP 基因的转录上调,从而增加AD 发病风险[73]㊂在另一研究中也发现,空气细颗粒物可通过提高SH -SY5Y 细胞的DNA 甲基化水平,抑制突触相关基因的转录表达,增加自闭症的发病几率[74]㊂焊接烟雾暴露后,大鼠全脑组织的DNA 甲基化水平升高,端粒长度增加,神经退化标志蛋白表达上调,提示表观遗传变化㊁端粒长度与神经退行性改变之间的可能联系[75]㊂2㊀结论与展望(Conclusion and prospect )环境污染物可通过引起各种表观遗传修饰的改变而诱导神经毒性(表1)㊂基于现有的研究结果,我们发现环境污染物可以直接或通过氧化胁迫等其他机制间接引起表观遗传机制改变,进而导致神经系统功能相关基因表达失调,最终诱导神经毒性(图1)㊂然而,目前该领域研究仍存在一定的局限性㊂图1㊀环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制示意图注:AD 表示阿尔茨海默病,PD 表示帕金森病㊂Fig.1㊀Proposed epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutantsNote:AD stands for Alzheimer Disease,and PD stands for Parkinson Disease.第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展7㊀表1㊀环境污染物对表观遗传修饰的影响及其神经毒性效应T a b l e 1㊀E f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s o n e p i g e n e t i c m o d i f i c a t i o n s a n d t h e i r n e u r o t o x i c e f f e c t s环境污染物E n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s 研究对象S u b j e c t s表观遗传改变E p i g e n e t i c c h a n g e s 靶基因/蛋白质T a r g e t g e n e s /P r o t e i n s 神经毒性N e u r o t o x i c i t y 参考文献R e f e r e n c e s重金属H e a v y m e t a l s铝A l 人体血清H u m a n s e r u m大鼠海马组织R a t h i p p o c a m p u s小鼠海马组织M o u s e h i p p o c a m p u s大鼠脑组织R a t b r a i n t i s s u e人体血清H u m a n s e r u m大鼠海马组织R a t h i p p o c a m p u sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e认知障碍C o g n i t i v e i m p a i r m e n t [17]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P 阿尔茨海默病A l z h e i m e r D i s e a s e[18]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P阿尔茨海默病A l z h e i m e r D i s e a s e[19]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e记忆和认知缺陷M e m o r y a n d c o g n i t i v e d e f i c i t s[20]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[21]ʏH 3K 27m e 3ʏH 3K 9m e 2ˌB D N F ,ˌE G R 1学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[22]ˌH 3K 9a cˌH 4K 12a cˌB D N F学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[23]砷A s大鼠皮质㊁海马组织R a t c o r t e x a n d h i p p o c a m p u sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n雌性小鼠海马齿状回组织F e m a l e m i c e h i p p o c a m p a l d e n t a t e g y r u sˌH 3K 9a cˌH 3K 4m e 3雄性小鼠海马齿状回组织M a l e m i c e h i p p o c a m p a l d e n t a t e g y r u sʏH 3K 9a cʏH 3K 4m e 3小鼠皮质㊁海马组织M o u s e c o r t e x a n d h i p p o c a m p u sˌH 3K 9a c 小鼠海马组织M o u s e h i p p o c a m p u sʏm i R -219全基因组G e n o m e -w i d e学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[25]全基因组G e n o m e -w i d e海马神经元发生障碍㊁抑郁症H i p p o c a m p a l n e u r o n a l d y s f u n c t i o n a n d d e p r e s s i o n[26]全基因组G e n o m e -w i d e空间和情景记忆能力损伤I m p a i r m e n t o f s p a t i a l a n d e p i s o d i c m e m o r y[27]ˌC a M K Ⅱ学习记忆障碍以及突触损伤L e a r n i n g a n d m e m o r y i m p a i r m e n ta n d s y n a p t i c d a m a g e[28]8㊀生态毒理学报第18卷续表1环境污染物E n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s 研究对象S u b j e c t s表观遗传改变E p i g e n e t i c c h a n g e s 靶基因/蛋白质T a r g e t g e n e s /P r o t e i n s 神经毒性N e u r o t o x i c i t y 参考文献R e f e r e n c e s 锰M n人体血清H u m a n s e r u mˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏN O S 2神经炎症N e u r o i n f l a m m a t i o n[29]S H -S Y 5Y 细胞S H -S Y 5Y c e l l sʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌP a r k i nˌP I N KˌT HˌP I N K 1-P A R K 2帕金森病P a r k i n s o n s D i s e a s e多巴胺生物合成减少R e d u c e d d o p a m i n e b i o s y n t h e s i s线粒体功能障碍M i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n[30]小鼠脑组织M o u s e b r a i n t i s s u eʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌM i d 1ˌN r 2f 1ˌA t p 1a 3海马神经发生持续中断,多巴胺能中间神经元数量减少S u s t a i n e d d i s r u p t i o n o f h i p p o c a m p a l n e u r o g e n e s i s a n dd e c r e a s e d n u m b e r s o f d o p a m i n e r g i c i n t e r n e u r o n s[31]P C 21细胞㊁S H -S Y 5Y 细胞P C 21c e l l s a n d S H -S Y 5Y c e l l sˌH 3a cˌH 4a c全基因组G e n o m e -w i d e细胞凋亡C e l l a p o p t o s i s[33]铅P b小鼠皮质组织M o u s e c o r t i c a l t i s s u e小鼠额叶皮层组织M o u s e f r o n t a l c o r t e x t i s s u e小鼠皮质组织M o u s e c o r t i c a l t i s s u e小鼠脑组织M o u s e b r a i n t i s s u eʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌN R 3C 1认知功能障碍C o g n i t i v e d y s f u n c t i o n[34]ʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌ神经分化相关基因ˌG e n e s i n v o l v e d i n n e u r a ld i f fe r e n t i a t i o n促进神经退化P r o m o t e n e u r o d e g e n e r a t i o n[36]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[37]ˌH 2K 9a cˌH 3K 4m e 2ʏH 3K 27m e 3全基因组G e n o m e -w i d e阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[38]ˌm i R -106bˌm i R -124ʏA P PʏS P 1阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[39]汞H g 无机汞H g 甲基汞M e H g 人体血清H u m a n s e r u mʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌP O N 1认知障碍C o g n i t i v e d y s f u n c t i o n[40]斑马鱼Z e b r a f i s hʏM a l a t 1/神经发育异常N e u r o d e v e l o p m e n t a l d i s o r d e r[41]N S C 细胞N S C c e l l sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏP 16ʏP 21细胞周期阻滞C e l l c y c l e a r r e s t[43]L U H M E S 细胞L U H M E S c e l l sʏH 3K 27m e 3ˌT H细胞周期阻滞;多巴胺生物合成受抑制C e l l c y c l e a r r e s t ;I n h i b i t i o n o f d o p a m i n e b i o s y n t h e s i s[44]。
组学技术在环境毒理学中的应用-案例研究
组学技术在环境毒理学中的应用-案例研究组学技术在环境毒理学中的应用主要包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等技术。
这些技术可以帮助研究人员全面、系统地了解环境污染物对生物体的影响，并揭示毒素诱导的分子机制和生物响应。
以下是一个环境毒理学中应用组学技术的案例研究：研究对象：小鼠研究目标：探究苯并[a]芘（BaP）等环境污染物引起的基因表达变化以及潜在的生物响应机制。
研究步骤：1. 通过转录组学技术获取BaP暴露小鼠和对照小鼠的RNA样本，利用高通量测序技术对转录组进行全面的分析。
2. 运用生物信息学分析方法对测序数据进行处理和筛选，找出差异表达基因（DEGs）。
3. 利用基因表达谱数据进行生物信息学分析，包括通路富集分析、转录因子分析和亚细胞定位分析等，以揭示BaP暴露对小鼠基因调控网络的影响。
4. 利用蛋白组学技术对DEGs进行验证，通过质谱分析鉴定差异表达的蛋白质。
5. 基于代谢组学技术对BaP暴露小鼠和对照小鼠的代谢产物进行分析，以揭示代谢途径的改变。
研究结果：1. 转录组学分析发现BaP暴露引起了大量基因的差异表达，包括一些与DNA修复、细胞凋亡、氧化应激和免疫反应等相关的基因。
2. 通路富集分析发现，BaP暴露可能影响多个通路，包括代谢通路、细胞凋亡通路和DNA修复通路等。
3. 转录因子分析揭示了一些差异表达基因可能关联的转录因子，进一步揭示了BaP暴露对基因调控的影响机制。
4. 蛋白组学分析发现了一些与差异表达基因相关的差异表达蛋白，进一步验证了基因表达谱数据的可靠性。
5. 代谢组学分析揭示了BaP暴露引起的代谢路径的变化，进一步揭示了BaP对代谢的潜在影响。
通过以上研究，可以深入地了解BaP等环境污染物对小鼠基因表达、蛋白质表达和代谢的影响，揭示了其潜在的生物毒性机制，为环境污染物的风险评估和环境健康保护提供了科学依据。
生态基因组学研究进展
生态基因组学研究进展生态基因组学是生态学和基因组学的交叉学科，旨在了解生物群落的遗传多样性和功能。
在过去的几十年中，随着DNA测序技术的发展和DNA信息学分析的进步，生态基因组学已经成为一个极为活跃的领域，为我们认识和保护生物多样性以及理解生态系统的生物地球化学循环提供了新的手段。
1. 生态基因组学的研究对象生态基因组学研究的对象是生态系统中的微生物、植物、动物等所有生物，这些生物群落构成了地球上生命的重要组成部分。
生态基因组学不仅可以描述不同群落的种类和多样性，还可以分析生物间的互动关系，以及群落内的基因流及功能调节机制。
2. 生态基因组学的应用领域生态基因组学的应用领域十分广泛。
例如，生态基因组学被应用于环境污染监测中，通过对生物群落中污染物代谢和分解的基因进行分析，可以准确地了解污染物在生态系统中的分布和转化过程，进而提供有效的污染治理措施。
此外，生态基因组学也被应用于疾病的研究中。
通过对人体微生物群落基因组的深度分析，可以确定某些疾病发生的原因和机制，为科学家们发掘新型疾病治疗方案提供了新的研究思路。
3. 生态基因组学的研究进展（1）微生物革命：微生物是生态系统中最广泛存在的生物类群之一。
通过生态基因组学的研究，科学家们已经揭示了微生物控制生态系统能量和物质循环的机制以及其在生物群落功能中的重要地位。
同时，也让我们更加深入地了解了细菌以及其他微生物与宿主机体在基因和代谢水平上的关系。
（2）大规模基因组数据的挖掘：生态基因组学需要处理的基因组数据量非常大，这对于数据挖掘和信息发现提出了很高的要求。
随着机器学习、深度学习等技术的不断发展，科学家们已经成功地挖掘出了许多社区信息以及生物代谢网络等信息。
同时也发现了一些新的群落与物种，为我们认识生物多样性提供了新思路和方法。
（3）生态环境遗传学的崛起：环境遗传学是生态基因组学中的重要分支之一。
它的研究对象是生态系统与环境的相互作用中产生的基因组变异和进化过程，以及这些变异对群落组成和功能的影响。
环境毒理学表观遗传修饰催化机制详解
环境毒理学表观遗传修饰催化机制详解表观遗传修饰是指在基因组水平上对基因的功能进行调控，而不改变DNA序列本身。
在环境毒理学研究中，表观遗传修饰的催化机制起到重要作用。
本文将详细解释环境毒理学中的表观遗传修饰催化机制，并探讨其对生物体的影响。
表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA表达调控等多个层面。
这些修饰可以通过改变染色质的结构和功能，影响基因的表达状态。
环境毒理学中，环境污染物可以通过直接或间接地作用于这些修饰机制，从而改变基因表达和细胞命运。
首先，DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰方式之一。
DNA甲基化是指DNA 分子上的甲基基团与某些碱基（通常是胸腺嘧啶）相结合的过程。
在环境毒理学中，DNA甲基化的催化机制可以通过污染物的介入来发生改变。
一些环境污染物，如多氯联苯（PCB）和苯并[a]芘（BaP），可作为DNA甲基转移酶的底物或抑制剂，导致DNA甲基化水平的改变。
这种改变可能会影响基因的表达，从而导致细胞的异常功能和疾病的发生。
其次，组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传修饰方式。
组蛋白是染色质结构的主要组成部分，通过不同的修饰方式如乙酰化、甲基化、磷酸化等，可以改变染色质的结构和功能。
环境污染物可以通过直接或间接地干扰组蛋白修饰酶的活性，从而改变组蛋白的修饰模式。
例如，一些有机溶剂可以抑制乙酰化修饰酶的活性，导致组蛋白乙酰化水平的下降，进而影响基因的表达。
此外，环境污染物还可以直接与组蛋白结合，改变其结构和功能，进而影响基因的表达和细胞功能。
非编码RNA表达调控是近年来被广泛研究的表观遗传修饰方式之一。
在基因组中，大约90%的RNA转录出来后并没有编码成蛋白质，而是具有调控基因表达的功能。
环境污染物可以通过直接或间接地调控非编码RNA的表达，从而影响基因的转录和翻译过程。
例如，一些有机污染物可以干扰长链非编码RNA的表达，从而改变基因的表达模式。
此外，环境污染物还可以通过干扰非编码RNA与其靶标的结合，进一步影响基因表达和细胞功能。
微囊藻毒素对微生物的生态毒理学效应研究进展
微囊藻毒素对微生物的生态毒理学效应研究进展
杨翠云;刘苏静;周世伟;夏传海;刘永定
【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2009(004)004
【摘要】微囊藻毒素是一类由蓝藻产生的具有肝毒性的环状肽类化合物,是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素,也是蓝藻水华污染过程中产量最大、危害最严重的藻毒素种类.论文根据微囊藻毒素对微生物(包括微型浮游植物、细菌、真菌)生态毒理学效应最新的研究进展,简要综述了微囊藻毒素的产生、理化性质以及对微生物的毒性效应,并对此研究领域进行了展望.
【总页数】7页(P602-608)
【作者】杨翠云;刘苏静;周世伟;夏传海;刘永定
【作者单位】中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院水生生物研究所,武汉430072
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5
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5.微塑料对海洋生物生态毒理学效应研究进展 [J], 薄军;陈梦云;方超;郑榕辉;王素敏;洪幅坤;张玉生;;;;;;;
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4 动物生态与保护生物学院重点实验室简介
中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室实验室的前身是建立于1964年的中国科学院动物研究所动物生态学实验室。
在历代科学家和研究人员不懈地创新和努力下，从上世纪六十年代野生大熊猫研究的开创性工作、到九十年代初动物生态与保护生物学体系的建立，直至今日在宏、微观生物学领域所取得的卓著成就，实验室不仅已成为国内顶尖的动物生态学与保护生物学研究团队，并在同类领域内已具有相当的国际影响力。
实验室目前有十三个一流的科研团队，其中四人为杰出青年基金获得者，七人为中国科学院“百人计划”获得者，1人入选国家青年千人计划。
实验室80%以上的研究工作来自各类国家级项目和国际合作项目，每年所获得的科研经费在数千万元左右。
实验室与国际一流大学和科研机构（例如，哈佛大学，耶鲁大学，牛津大学，剑桥大学，伦敦大学学院等）有广泛和深入的合作，在大型兽类的基因组生态学、鸟类生态学、行为与进化生态学、生理生态学、入侵生态学、污染生态学、濒危珍稀动物的保护与管理、重要野生动物疫病的监测与预警等领域已获得一批具有国际一流水准的研究成果。
真诚地欢迎你加入动物生态与保护生物学实验室的研究团队，分享我们的科学理念与成就，贡献你的智慧，创造你的未来。
我们所关注的主要科学问题1．重要野生动物功能基因组及其进化历史：进入本世纪以来基因组技术的发展为揭示野生动物形状的进化机制及其演化历史提供了一个全新的技术手段。
例如，大熊猫与小熊猫均具有伪拇指，也称“第六指”，这一特殊的形态器官是食竹食性特化的趋同结果吗？大熊猫具有800多万年的进化历史，目前仅存于六大隔离的山系，是否有可能准确地重建大熊猫的演化历史？2．野生动物婚配制度的进化生物学：动物的婚配制度是动物种群繁衍发展的关键环节，也是最复杂的动物行为特征。
例如，为什么有些动物是一夫一妻，而另一些则是一夫多妻，一妻多夫，或混交制？不同的婚配制度所包含的进化生物学意义是什么？婚配制度与自然环境有什么样的关系？婚配制度的进化生物学还涉及性比、性选择及两性冲突等许多重要的科学问题。
斑马鱼在生态毒理学研究及环境监测中的应用
斑马鱼在生态毒理学研究及环境监测中的应用刘辉;戴家银【摘要】斑马鱼作为一种新型的模式动物,由于其易于饲养、体外受精、产卵量大、胚胎透明及体外发育等优点,已经广泛应用于生物研究的多个领域. 近年来,斑马鱼及其胚胎也已经广泛应用于生态毒理学研究及环境监测领域;并且随着转基因斑马鱼技术的建立,斑马鱼及其胚胎将更好地应用于生态毒理学研究和环境监测.%Zebrafish, a new type of model animal , has been widely used in many fields of biological research be-cause of its low cost , ability of external fertilization , high fecundity , allowance of embryo transplant , and ectogenesis .Re-cently, zebrafish and its embryos have been widely used in ecotoxicological studies and environmental monitoring .Further-more, with the maturation of zebrafish transgenic techniques , a new era has come for environmental pollution monitoring .【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2015(023)005【总页数】6页(P529-534)【关键词】斑马鱼;生态毒理学;环境监测;转基因【作者】刘辉;戴家银【作者单位】中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室,中国科学院动物研究所,北京 100101;蚌埠医学院医学检验系,安徽蚌埠 233030;中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室,中国科学院动物研究所,北京 100101【正文语种】中文【中图分类】Q95-33斑马鱼（英文名：zebrafish，拉丁文名：Danio rerio）也称为蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼或印度斑马鱼等，属于硬骨鱼类，辐鳍亚纲（Actinopterygii），鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鱼丹属（Danio）。
211036564_环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第1期2023年2月V ol.18,No.1Feb.2023㊀㊀基金项目:农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室开放课题(ZJK202010);中央高校基本科研业务费专项资金(2662021SCPY003)㊀㊀第一作者:孔娟(1995 ),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*****************㊀㊀#共同通信作者(Co -corresponding author),E -mail:*********************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220124001孔娟,范博雅,原居林,等.环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应[J].生态毒理学报,2023,18(1):426-439Kong J,Fan B Y ,Yuan J L,et bined effects of environmental concentration of oxytetracycline and polystyrene microplastics on intestinal tract of juvenile yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco )[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(1):426-439(in Chinese)环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应孔娟1,范博雅1,原居林2,#,余丽琴1,3,*1.华中农业大学水产学院,武汉4300702.浙江省淡水水产研究所,湖州3130003.教育部长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心,武汉430070收稿日期:2022-01-24㊀㊀录用日期:2022-04-24摘要:近年来,氧四环素(oxytetracycline,OTC)和聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics,PS -MPs)在水环境中被广泛检出㊂为了探究PS -MPs 与OTC 对鱼类的联合毒性效应,选取黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco )幼鱼为研究对象,将其暴露于CON(对照)组㊁环境浓度OTC(500ng ㊃L -1)单独组㊁MPs -L(100μg ㊃L -1PS -MPs)单独组㊁MPs -L+OTC(100μg ㊃L -1PS -MPs+500ng ㊃L -1OTC)复合组㊁MPs -H(1000μg ㊃L -1PS -MPs)单独组和MPs -H+OTC(1000μg ㊃L -1PS -MPs+500ng ㊃L -1OTC)复合组中28d ,研究了OTC 和PS -MPs 单独以及联合暴露对幼鱼生长㊁肠道结构和肠道菌群的影响㊂研究结果表明,与对照组相比,OTC 单独暴露和MPs -L 单独暴露对黄颡鱼幼鱼体长㊁体质量及体质量增长率,肠道氧化应激酶(超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT))活性及消化酶(胰蛋白酶(trypsin,TRS)㊁淀粉酶(amylase,AMS)和脂肪酶(lipase,LPS))活性,肠道微生物组成(OTU 数目㊁α多样性㊁β多样性以及门㊁属水平上物种组成的相对丰度)均无显著性影响㊂但MPs -L+OTC 复合暴露导致SOD 和CAT 活性显著升高,引起肠道空泡化㊁肠上皮细胞轻微缺失,变形菌门的相对丰度显著升高,且与OTC 单独暴露组相比,肠道CAT 活性显著性升高㊂MPs -H 单独暴露抑制了黄颡鱼幼鱼体质量和体质量增长率,引起了肠道空泡化,导致其肠道SOD 和CAT 活性显著升高,消化酶TRS 和LPS 活性显著降低,厚壁菌门相对丰度显著降低㊂与MPs -H 单独组和OTC 单独组相比,MPs -H+OTC 组进一步加剧肠道氧化酶活性升高㊁消化酶活性降低㊁肠道损伤和肠道菌群紊乱㊂相关性分析表明,肠道葡萄球菌属和体长显著负相关;鲸杆菌属和SOD 显著正相关;气单胞菌属与LPS 显著负相关,与AMS 显著正相关㊂上述结果显示PS -MPs 高浓度单独以及与OTC 复合暴露可能通过肠道损伤以及肠道菌群的改变,进而影响肠道消化酶活性,导致黄颡鱼幼鱼生长抑制㊂此外,PS -MPs 和OTC 的复合肠道毒性表现出显著的协同效应㊂本实验结果将为水环境中抗生素和微塑料的生态风险评价提供新的视角和理论依据㊂关键词:聚苯乙烯微塑料;氧四环素;黄颡鱼幼鱼;复合暴露;肠道菌群文章编号:1673-5897(2023)1-426-14㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ACombined Effects of Environmental Concentration of Oxytetracycline and Polystyrene Microplastics on Intestinal Tract of Juvenile Yellow Catfish (Pelteobagrus fulvidraco )Kong Juan 1,Fan Boya 1,Yuan Julin 2,#,Yu Liqin 1,3,*第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应427㊀1.College of Fisheries,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China2.Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,Huzhou313000,China3.Engineering Research Center of Green Development for Conventional Aquatic Biological Industry in the Yangtze River Economic Belt,Ministry of Education,Wuhan430070,ChinaReceived24January2022㊀㊀accepted24April2022Abstract:In recent years,oxytetracycline(OTC)and polystyrene microplastics(PS-MPs)have been widely detec-ted in aquatic environment.In order to investigate the combined effects of PS-MPs and OTC on intestinal tract of fish,we investigated the effects of OTC and PS-MPs exposure on growth,intestinal structure and intestinal micro-flora of fish.Juvenile yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco)were exposed to500ng㊃L-1OTC(OTC),100(low concentration)(MPs-L)and1000μg㊃L-1(high concentration)(MPs-H)PS-MPs,or their combination(combined MPs-L+OTC,combined MPs-H+OTC)for28d.Results showed that OTC and MPs-L alone exposure had no sig-nificant effect on the growth,intestinal antioxidant enzyme activities(including superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)),digestive enzyme activities(including trypsin(TRS),amylase(AMS)and lipase(LPS)),or intesti-nal flora(including OTU number,alpha diversity,beta diversity,and relative abundance of species composition at phylum level and genus level)of juvenile yellow catfish.However,combined MPs-L+OTC exposure significantly increased SOD and CAT activities,induced intestinal vacuolation and slight loss of intestinal epithelial cells,as well as significantly increased the relative abundance of Proteobacteria as compared to the control group.Intestinal CAT activity was significantly increased in the combined MPs-L+OTC exposure group as compared to the OTC alone exposure group.Moreover,MPs-H alone exposure inhibited the body weight and weight gain rate of juvenile yellow catfish,induced intestinal vacuolation,significantly increased the activities of SOD and CAT,significantly decreased the activities of digestive enzymes TRS and LPS,and significantly decreased the relative abundance of pared with the MPs-H group and OTC group,the effects on oxidase activities,digestive enzyme activities,intestinal injury and intestinal flora were further exacerbated in the combined MPs-H+OTC group.In ad-dition,correlation analysis showed that a significant negative correlation between Staphylococcus and body length. Abundance of Cetobacterium was positively correlated with the activities of SOD.Aeromonas was negatively cor-related with the activity of LPS while positively correlated with AMS.Thus,high concentration of PS-MPs alone or combined OTC exposure might affect intestinal digestive enzyme activities through intestinal injury and changes in the intestinal flora,resulting in growth inhibition of juvenile yellow catfish.In addition,the combined intestinal tox-icity of PS-MPs and OTC showed significant synergistic effects.The results of this study might provide a new per-spective and theoretical basis for ecological risk assessment of antibiotics and microplastics in aquatic environment. Keywords:polystyrene microplastic;oxytetracycline;juvenile yellow catfish;combined exposure;intestinal flora㊀㊀抗生素(antibiotics)能干扰或抑制致病微生物的存在,广泛使用于人类及动物的疾病防治㊁畜牧及水产养殖等领域[1]㊂据统计,全世界抗生素的使用量可达10~20万t[2],其中我国是抗生素最大的生产国和消费国,2013年我国抗生素的使用量已高达16.2万t[3]㊂大多数的抗生素很难被人体或动物全部吸收,25%~75%的抗生素会以原药或代谢产物的形式通过粪便或尿液排入水环境中,已在各种水体中检测到了其广泛存在[4],主要包括四环素类㊁大环内酯类㊁磺胺类㊁喹诺酮类和氯霉素类[5-8]㊂四环素类抗生素(tetracyclines,TCs)作为我国生产量和实际使用量最大的抗生素,在各种水体中被频繁地检测到[9-12]㊂其中,氧四环素(oxytetracycline, OTC)的检出浓度最高㊂在黄浦江中OTC和TC的最高浓度分别可达479ng㊃L-1和440ng㊃L-1[13]㊂在中国的海陵湾地区水体中检测到了21种抗生素,其中OTC的浓度最高,平均浓度为417.76ng㊃L-1,最高浓度高达15.16μg㊃L-1[12]㊂有关OTC在环境浓度慢性暴露下对水生生物的影响研究较少,近几年的研究发现环境浓度OTC影响鱼类的肠道结构和微生物群落㊂环境浓度OTC(420ng㊃L-1)暴露或者投喂罗非鱼导致其生长受抑制㊁肠道屏障被破坏和428㊀生态毒理学报第18卷肠道菌群失调[14-15]㊂420ng㊃L-1OTC暴露导致斑马鱼抗氧化性显著降低,肠道屏障功能障碍,炎症因子表达量增加,肠道菌群受到干扰[16]㊂在水生态系统中,抗生素对水生生物的毒性效应也会受到一些非生物因素的影响,例如pH㊁温度㊁紫外线以及其他环境污染物(重金属㊁有机污染物等)㊂在众多的水环境污染物中,微塑料不仅能够直接对水生生物产生危害还可以作为载体吸附抗生素[17],因此其对抗生素毒性效应的影响亟待得到关注㊂微塑料(microplastics,MPs)被定义为尺寸<5mm 的塑料颗粒,具有粒径小㊁不易被降解等特点㊂环境调查发现我国水体㊁土壤和沉积物等环境中均有微塑料,且水体是其主要归趋地之一[18]㊂调查表明黄浦江与长江河口交界处微塑料浓度为(4137.3ʃ2461.5)个㊃m-3[19]㊂武汉市湖泊水体大多流动性较小或是静水,其微塑料的累积量高达(8925ʃ1591)个㊃m-3[20]㊂对水环境中微塑料种类的检测发现,聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics,PS-MPs)是其主要成分之一[21]㊂MPs极易通过摄食等途径在水生生物体内累积,其在各种鱼类㊁中华白鳍豚和东亚江豚等肠道内均被检测到[22-25]㊂此外,微塑料能够抑制鱼类摄食和生长,引起肠道损伤和炎症,氧化应激毒性和生殖毒性等多种毒性效应[26-29]㊂其中,微塑料对鱼类肠道损伤和微生物群落的影响近年来受到了广泛的关注㊂研究发现PS-MPs暴露导致斑马鱼肠道菌群失调㊁炎症反应和肠道屏障功能障碍[30-32]㊂为了探索PS-MPs和OTC对鱼类的联合毒性效应,本文以黄颡鱼幼鱼为实验生物,探究了环境浓度OTC(500ng㊃L-1)和PS-MPs(100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1)单独及联合暴露28d后对黄颡鱼幼鱼的生长㊁肠道氧化应激㊁肠道消化酶活性㊁肠道组织病理及肠道菌群的影响㊂本研究从个体水平㊁器官水平和微生物水平评价OTC和PS-MPs对黄颡鱼幼鱼的肠道影响,进而为评价PS-MPs和OTC的环境健康风险评价提供理论依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀实验试剂氧四环素,CAS号为6153-64-6,纯度ȡ97%,购自上海麦克林生化科技有限公司,使用去离子水将OTC溶解配制成浓度为50μg㊃mL-1的储备液,储存在4ħ冰箱里㊂聚苯乙烯微塑料(PS-MPs,球形,5μm,纯度ȡ99%)购自天津倍思乐色谱技术开发中心,用去离子水将微塑料原液稀释为1mg㊃mL-1的储备液,储存在4ħ冰箱;PS-MPs储备液使用前需超声20min并用曝气24h的自来水稀释为100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1的暴露液㊂1.2㊀黄颡鱼驯养及暴露实验黄颡鱼鱼苗购自武汉市黄优源渔业发展有限公司,将刚出苗3d的黄颡鱼鱼苗转移至室内养殖系统中进行为期2周的暂养㊂在实验开始时,选取规格一致的健康仔鱼(平均体长(13.38ʃ0.62)mm,平均体质量(0.028ʃ0.003)g)分别暴露在CON组㊁OTC (500ng㊃L-1)组㊁MPs-L(100μg㊃L-1PS-MPs)组㊁MPs-H(1000μg㊃L-1PS-MPs)组㊁MPs-L+OTC(100μg㊃L-1PS-MPs+500ng㊃L-1OTC)组和MPs-H+OTC (1000μg㊃L-1PS-MPs+500ng㊃L-1OTC)组共6个浓度组中,每组有3个平行缸,每缸60尾鱼于18L暴露液中㊂暴露养殖水为曝气24h的自来水,暴露过程中持续稳定曝气(防止微塑料颗粒凝聚)㊂保持稳定的水质参数:pH=7~8,水温(26.1ʃ0.8)ħ,溶氧(16.4ʃ0.2)mg㊃L-1,光周期为14h/10h(昼/夜),每天更换一半暴露液㊁暴露时间为28d㊂每天投喂商业饲料3次(10:00㊁16:00和21:00),投喂率为鱼体质量的4%㊂1.3㊀PS-MPs的表征分析表征前,将PS-MPs进行20min超声,采用超纯水制备5mL浓度为1000μg㊃L-1的测试溶液㊂采用透射电子显微镜(TEM,HT-7700,日本日立有限公司)来观察PS-MPs的尺寸;用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS,英国马尔文公司)测得PS-MPs的Zeta电位㊂1.4㊀生长指标的测定暴露结束后,黄颡鱼禁食24h后浸泡在<4ħ的冰水浴中安乐死㊂每个浓度每个平行取25尾黄颡鱼幼鱼,测量并分析黄颡鱼幼鱼的体质量(body weight,BW)㊁体长(body length,BL)(黄颡鱼幼鱼吻到尾鳍基部)㊁存活率(survival rate,SR)㊁体质量增长率(weight gain rate,WGR)㊁特定生长率(specific growth rate,SGR)(d-1)㊁脑体比(brain somatic index, BSI)和肝体比(hepato somatic index,HSI)㊂计算公式如下:存活率(SR)=(N t/N)ˑ100%体质量增长率(WGR)=(W t-W0)/W0ˑ100%特定生长率(SGR)=[ln(W t/N t)-ln(W/N)]/tˑ100%肝体比(HSI)=(肝脏质量/W t)ˑ100%脑体比(BSI)=(脑质量/W t)ˑ100%式中:W为试验鱼的初始质量(g),W t为试验鱼的第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应429㊀终末质量(g),N和N t为试验开始和试验结束时每组鱼尾数,t为试验时间(d)1.5㊀肠道组织病理分析暴露28d后,随机从每个浓度每个平行缸取4尾黄颡鱼幼鱼用于肠道组织病理学分析㊂取样前禁食24h,解剖取中肠组织(1~2cm)于4%多聚甲醛缓冲液固定24~48h㊂肠组织经乙醇㊁二甲苯透明液脱水,石蜡包埋㊁切片(4μm),苏木精和伊红(H& E)染色切片,使用立体显微镜(Leica,M205FA,德国)的400倍镜头进行组织病理学评估㊂1.6㊀肠道抗氧化酶的活性测定暴露28d后,禁食24h,随机从每个浓度每个平行中取3尾黄颡鱼幼鱼肠道测定酶的活性㊂装入EP冻存管迅速置于液氮冷冻,置于-80ħ冰箱中保存待测㊂使用组织细胞破碎仪(Buller Blender,Tis-sulyser-24,美国Next Advance公司)将肠组织样品和0.86%冷生理盐水均质,4ħ离心15min(2500r㊃min-1)㊂取上清液按照试剂盒说明书测定肠道超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)酶活性㊂蛋白质浓度采用蛋白定量(TP)测定盒(BCA微板法)测定㊂实验所使用酶标仪为Synergy H4(Biotek,VT,USA),使用的商业化试剂盒均购自南京建成研究所㊂1.7㊀肠道消化酶的活性测定暴露结束后,每个浓度每个平行中取3尾黄颡鱼幼鱼用于消化酶活性的测定,肠道的取样方法和前处理方法同1.6㊂测定肠道胰蛋白酶(trypsin, TRS)㊁淀粉酶(amylase,AMS)和脂肪酶(lipase,LPS)活性的方法参照各试剂盒说明书㊂酶液蛋白质浓度采用蛋白定量(TP)测定盒(BCA微板法)测定㊂所使用的商业化试剂盒购自南京建成研究所㊂1.8㊀肠道菌群16S rRNA扩增子测序分析暴露结束后,随机从各实验组的每个平行缸中在无菌操作台上取6尾黄颡鱼幼鱼肠道用于肠道菌群测序检测㊂具体操作如下:冰盘上无菌解剖黄颡鱼肠道并收集,液氮速冻后转移至-80ħ冰箱中待测㊂将取得的36个肠道样本送至广东美立康生物科技有限公司进行测序分析㊂具体分析流程如下:采用两步PCR法,使用通用正向引物515F(5 -GT-GYCAGCMGCCGCGGTA-3 )和反向引物909R(5 -CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3 )扩增微生物16s rRNA基因的V4-V5高变区,扩增条件为94ħ预变性3min,然后进行30个循环的常规扩增(94ħ变性40s,56ħ退火60s,72ħ延伸60s),最后72ħ延伸10min㊂使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳后采用sanPrep DNA凝胶回收试剂盒(生工,中国)纯化,所有纯化的DNA等量混合后,对高变区进行PCR扩增后用Illumina Miseq测序平台对PCR扩增产物进行测序,鉴定群落中的微生物组成和其相对丰度㊂采用QIIME1.9.0软件按照序列97%的相似性将序列聚类为OTUs(Operational Taxonomic Units),计算α多样性指数和UniFrac距离矩阵并进行PCoA排序分析㊂1.9㊀数据分析与统计所有数据均以 平均值ʃ标准误差 (MeanʃSEM)表示,双因素方差分析(Two-way ANOV A)方法分析试验数据的差异性(IBM SPSS Statistics22)㊂如果差异达到显著水平(P<0.05),选择Duncan法进行多重比较分析㊂运用R(4.1.2)采用相关分析方法分析黄颡鱼幼鱼生长㊁肠道氧化应激水平和肠道消化酶活性与肠道微生物之间的相关性㊂2㊀结果(Results)2.1㊀聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)的表征如图1所示,用透射电子显微镜观察到PS-MPs 的尺寸为5μm(图1(a)),用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS)测得PS-MPs的Zeta电位为-44.3mV(图1(b)),表明PS-MPs在超纯水中,直径为5μm,粒径几乎没有差异㊂2.2㊀OTC和PS-MPs暴露28d后对幼年黄颡鱼生长性能的影响如表1所示,暴露28d后,与对照组相比,OTC 组㊁MPs-L组和MPs-L+OTC组的所有生长指标均无显著性差异;MPs-H组的体质量显著下降15.06%(P< 0.05),体质量增长率显著下降8.41%(P<0.05);MPs-H +OTC组的体质量显著下降15.45%(P<0.05),体质量增长率显著下降17.17%(P<0.05),SGR显著下降7.49%(P<0.05),BSI显著降低25.57%(P<0.05);此外,与MPs-H组相比,MPs-H+OTC组的BSI显著降低了19.79%(P<0.05)㊂2.3㊀中肠组织病理分析如图2所示,黄颡鱼肠组织结构可由黏膜层㊁肌层和浆膜层组成,淋巴细胞常在上皮细胞之间分布,多位于基底部㊂与对照组相比,OTC组和MPs-L组的肠道组织形态学完整,肠黏膜皱襞排列整齐,纹状缘清晰,边缘光滑,没有明显的病理损伤(图2(a)㊁2 (b)和2(d))㊂在MPs-H组中,肠道出现轻微的组织430㊀生态毒理学报第18卷损伤:少量空泡化现象(图2(c))㊂在MPs -L+OTC 组和MPs -H+OTC 组中,组织损伤加剧:部分淋巴细胞轻微向游离面游走,空泡化变性,肠上皮细胞轻微缺失,固有膜结缔组织疏松(图2(e)和2(f))㊂2.4㊀黄颡鱼幼鱼肠道抗氧化酶的活性如图3所示,与对照相比,OTC 组和MPs -L 组未受到显著性影响;MPs -H 组的SOD 活性和CAT活性分别显著提高了35.3%(P <0.05)和100.8%(P <0.05);MPs -L+OTC 组的SOD 活性和CAT 活性分别显著提高了42.7%(P <0.05)和85.5%(P <0.05);MPs -H+OTC 组中SOD 活性和CA T 活性分别显著提高了120.5%(P <0.05)和169.6%(P <0.05)㊂此外,与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 组CAT 活性和SOD 活性分别显著提高了34.3%(P <0.05)和63.7%(P <0.05)㊂图1㊀聚苯乙烯微塑料(PS-MPs )的尺寸和Zeta 电位注:(a)PS -MPs 透射电子显微镜图;(b)PS -MPs 在水溶液中的Zeta 电位㊂Fig.1㊀Dimensions and compositions of polystyrene microplastics (PS -MPs)Note:(a)TEM of PS -MPs;(b)Zeta potential of PS -MPs.表1㊀氧四环素(OTC )和PS-MPs 单独及复合暴露对幼年黄颡鱼生长性能的影响Table 1㊀Effects of oxytetracycline (OTC)and PS -MPs alone or in combination exposureon growth performance of juvenile yellow catfish指标Index CON OTC MPs -L MPs -L+OTC MPs -H MPs -H+OTC存活率(SR)/%Survival rate (SR)/%0.75ʃ0.040.71ʃ0.030.74ʃ0.020.72ʃ0.030.67ʃ0.050.71ʃ0.03体长(BL)/mm Body length (BL)/mm 24.77ʃ0.3324.72ʃ0.4723.99ʃ0.2623.82ʃ0.2624.27ʃ0.3024.31ʃ0.24体质量(BW)/mg Body weight (BW)/mg 279.40ʃ0.01a 274.74ʃ0.02a 245.62ʃ0.01ab 256.10ʃ0.01ab 237.32ʃ0.01b 236.24ʃ0.01b体质量增长率(WGR)/%Growth rate of body weight (WGR)/%897.85ʃ46.31a 881.20ʃ55.32ab 777.21ʃ40.04abc 814.53ʃ36.13abc 762.35ʃ38.08bc 743.70ʃ34.23c特定生长率(SGR)/d -1Specific growth rate (SGR)/d-18.96ʃ0.16a 8.90ʃ0.23a 8.69ʃ0.15ab 8.84ʃ0.14ab 8.43ʃ0.13ab 8.29ʃ0.15b肝体比(HSI)/%Hepato somatic index (HSI)/%2.12ʃ0.33 2.03ʃ0.29 1.85ʃ0.22 1.73ʃ0.17 1.85ʃ0.16 1.96ʃ0.14脑体比(BSI)/%Brain somatic index (BSI)/%3.05ʃ0.19a 2.72ʃ0.18ab 2.89ʃ0.18a 2.67ʃ0.15ab 2.83ʃ0.14a 2.27ʃ0.11b注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant difference among groups (P <0.05).第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应431㊀图2㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼鱼肠道组织的影响(400ˑ,比例尺为50μm )注:柱状上皮细胞(1);杯状细胞(2);固有层(3);淋巴细胞(4);空泡化(ң);肠上皮细胞缺失(һ);淋巴细胞向游离面游走(ʀ)㊂Fig.2㊀Effect of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on gut histologyof juvenile yellow catfish (400ˑ,scale bars 50μm)Note:Columnar epithelial cells (1);goblet cells (2);lamina propria (3);lymphocytes (4);vacuolation (ң);intestinal epithelial cells are absent (һ);lymphocytes migrate to the free surface (ʀ).图3㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼氧化应激酶活性的影响(n =3)注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.3㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on oxidative stress activityof juvenile yellow catfish gut (n =3)Note:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).2.5㊀黄颡鱼幼鱼肠道消化酶的活性如图4所示,与对照组相比,OTC 组㊁MPs -L 组和MPs -L +OTC 组的消化酶未受到显著性影响;MPs -H 暴露组的脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶(TRS)活性分别显著下降了35.61%(P <0.05)和48.01%(P <0.05);MPs -H+OTC 暴露组的LPS 和TRS 活性分别432㊀生态毒理学报第18卷图4㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响(n =3)注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.4㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on gut digestive enzyme activitiesof juvenile yellow catfish (n =3)Note:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).显著下降了47.73%(P <0.05)和60.25%(P <0.05)㊂2.6㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群的影响2.6.1㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群α多样性的影响和主成分分析㊀㊀α多样性中,Chao1指数为描述群落丰富度的指数,指数越大,代表对应的群落其丰富度就越高㊂Shannon 指数和Simpson 指数为描述群落多样性的指数,综合考虑了群落的丰富度和均匀度,其值越高,群落的多样性越高㊂如图5(a)所示,MPs -H +OTC 组OTUs 数目与对照组相比,显著下降(P <0.05),其余组别无显著性影响㊂如图5(b)㊁5(c)和5(d)所示,与对照组相比,所有处理组的Simpson 指数无显著性差异,MPs -H 组的Shannon 指数(菌群的物种多样性)显著性降低(P <0.05),MPs -H+OTC 组的Chao1指数(菌群丰富度)(P <0.05)和Shannon 指数(菌群的物种多样性)显著性降低(P <0.05)㊂如图5(e)所示,从Weighted Unifrac 距离来进行PCoA 分析,一个点代表一个样本,同种颜色的点表示相同的处理组㊂投影分析表明样本之间距离越近,在相应维度中的群落组成越相似㊂与对照组相比,MPs -H +OTC 暴露组发生了分离,其余组均有重合㊂2.6.2㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群门㊁属水平的影响在门水平上,共检出53个门(2个古细菌门和51个真细菌门)㊂如图6(b)所示,其中优势门(至少在一个样品的相对丰度超过1%)有变形菌门(Pro -teobacteria)㊁梭杆菌门(Fusobacteria)㊁厚壁菌门(Firm -icutes)㊁蓝藻门(Cyanobacteria)㊁酸杆菌门(Acidobacte -ria)㊁放线菌门(Actinobacteria )㊁拟杆菌门(Bacte -roidetes)㊁浮霉菌门(Planctomycetes)和软壁菌门(Te -nericutes)㊂如图6(a)所示,肠道菌群主要富集在3个门上:变形菌门(Proteobacteria)㊁梭杆菌门(Fuso -bacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)㊂对照组中变形菌门㊁梭杆菌门和厚壁菌门的相对丰度分别为38.44%㊁24.22%和15.53%;OTC 组中为33.73%㊁49.65%和13.74%;MPs -L 组中为27.63%㊁5.42%和13.01%;MPs -H 组中为43.56%㊁5.20%和2.52%;MPs -L +OTC 组中为78.57%㊁5.57%和2.65%;MPs -H+OTC 中为15.30%㊁79.32%和0.85%㊂与对照组相比,OTC 组㊁MPs -L 组肠道菌群无显著性变化;MPs -H 组中厚壁菌门的相对丰度显著下降83.77%(P <0.05);MPs -L+OTC 低浓度联合暴露组中变形菌门的相对丰度显著上升104.40%(P <0.05);MPs -H +OTC 高浓度联合暴露组中,变形菌门和厚壁菌门的相对丰度分别显著下降60.20%(P <0.05)和94.53%(P <0.05),梭杆菌门的相对丰度显著上升227.50%(P <0.05);此外,与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 中变形菌门的相对丰度显著下降64.87%(P <0.05),梭杆菌门的相对丰度显著上升了1425.38%(P <0.05)㊂在属水平上,如图6(c)所示,优势属主要有鲸杆菌属(Cetobacterium )㊁埃希氏菌属(Escherichia )和邻单胞菌属(Plesiomonas ),对照组中鲸杆菌属㊁埃希氏菌属和邻单胞菌属相对丰度分别为27.12%㊁25.91%和第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应433㊀图5㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道菌群α多样性指数和β多样性指数的影响注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.5㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on alpha diversity and beta diversity of intestinal microbiotain juvenile yellow catfishNote:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).0.69%,OTC 组中为49.65%㊁0.1%和24.09%,MPs -L 组中为5.23%㊁1.10%和6.63%,MPs -H 组中为5.04%㊁6.83%和20.99%,MPs -L +OTC 组中为5.53%㊁46.57%和1.99%,MPs -H +OTC 组中为79.31%㊁0.05%和14.75%㊂与对照组相比,在MPs -H+OTC 高浓度联合暴露组中,鲸杆菌属的相对丰度显著上升了192.44%(P <0.05);与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 组中鲸杆菌属的相对丰度显著上升了1373.61%(P <0.05)㊂2.6.3㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼的生理指标与肠道微生物之间的相关性分析㊀㊀如图7所示,葡萄球菌属(Staphylococcus )与体长成显著负相关(P <0.05)㊂鲸杆菌属(Cetobacterium )与SOD 成显著正相关(P <0.05),与BSI 成显著负相关(P <0.01)㊂气单胞菌属(Aeromonas )与LPS 成显著负相关(P <0.05),与AMS 成显著正相关(P <0.05)㊂3㊀讨论(Discussion )OTC 的滥用导致其在水环境中被频繁检测出,相关研究表明,环境中广泛存在的OTC 能够在水生生物体内累积[33],环境浓度OTC 能够通过PS -MPs 吸附加剧其在生物体内蓄积[34]㊂目前,OTC 和PS -MPs 联合暴露是否影响黄颡鱼幼鱼肠道健康损伤还是未知的㊂本研究通过OTC 和PS -MPs联合暴露黄颡鱼仔鱼28d ,探究其生长指标㊁肠道病理损伤㊁肠道抗氧化酶活性㊁消化酶活性及肠道菌群变化㊂毒理学实验中,生长是评价环境压力对生物影响的重要参数之一[35]㊂本研究中,环境浓度的OTC单独暴露对黄颡鱼幼鱼的生长无显著影响㊂这一结434㊀生态毒理学报第18卷图6㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道菌群组成的影响注:(a)各类群在门水平上的相对丰度;(b)门水平上肠道微生物组成;(c)属水平上的肠道微生物组成;标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.6㊀Effect of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on the intestinal microbialcomposition in juvenile yellow catfishNote:(a)Relative abundance of various groups at phylum level;(b)Gut microbiota composition at the phylum level;(c)Gut microbiotacomposition at the genus level;different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).果与之前的研究类似,420ng ㊃L -1OTC 暴露成年斑马鱼42d ,对其生长无显著影响,但引起成年代谢率显著性增加,表明鱼类需要额外的能量来耐受毒理学应激,而不是将其用于生长[35]㊂本实验中,100μg ㊃L -1PS -MPs 对黄颡鱼幼鱼的生长无显著性影响,但1000μg ㊃L -1PS -MPs 显著抑制黄颡鱼幼鱼的体质量增长㊂类似的研究也发现100mg ㊃L -1PS -MPs 暴露50d 后显著抑制了鲫鱼体质量增长[36],这可能是由于PS -MPs 会导致饱腹感,通过影响其进食来抑制其生长㊂本实验中MPs -H+OTC 组黄颡鱼幼鱼会显著降低其体质量,但与对应的MPs -H 和OTC 单独暴露组相比均无显著性㊂在肠道微生物与体长的相关性分析中发现,葡萄球菌属与体长成显著负相关㊂葡萄球菌属是一群革兰氏阳性球菌,其中金黄色葡萄球菌作为一种常见的致病菌,感染严重时能导致坏死性肺炎至肺组织坏死[37],表明金黄色葡萄球菌可能与黄颡鱼生长抑制相关㊂鱼类的肠道是一个重要的器官,不仅参与消化㊁吸收和免疫,而且还能充当有害物质入侵的屏障[32]㊂肠道的形态完整性在一定程度上可以反映肠道的健康状况[33,37]㊂我们的实验结果表明OTC 单独暴露(500ng ㊃L -1)对肠道无显著性病理损伤,但是有研究报道420ng ㊃L -1OTC 暴露斑马鱼48d 减少了斑马鱼肠道中杯状细胞的数量[35]㊂2个研究中结果的不一致可能与抗生素暴露浓度㊁暴露时间不同有关㊂近年来,一些研究探索微塑料暴露对生物肠道上皮细胞的影响[37],值得关注的是5μm 的PS -MPs 可以进入肠道,并穿过黏液屏障,与肠上皮细胞部分直接第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应435㊀图7㊀黄颡鱼幼鱼样本的细菌属丰度(>1%)与鱼类健康指数的Pearson相关性分析注:筛选了与鱼类健康指数显著相关的肠道微生物属,蓝色表示正相关,红色表示负相关;*P<0.05和**P<0.01表示该相关性分析具有显著差异;SOD表示超氧化物歧化酶,CAT表示过氧化氢酶, TRS表示胰蛋白酶,LPS表示脂肪酶,AMS表示淀粉酶,HSI表示肝体比,BSI表示脑体比,Length表示体长,Weight表示体质量㊂Fig.7㊀Pearson correlation analysis of bacterial abundance (>1%)and fish health index in juvenile yellow catfish samples Note:The intestinal microbe genera significantly correlated with fish health index were screened,with positive correlation in blue and negative correlation in red;*P<0.05and**P<0.01indicate significant differences in the correlation analysis;SOD stands for superoxide dismutase;CAT stands for catalase;TRS stands for trypsin;LPS stands for lipase;AMS stands for amylase;HSI stands for hepato somatic index;BSI stands for brain somatic index;Length stands for body length;Weight stands for body weight.接触[38]㊂本实验中,MPs-H组造成肠道少量空泡化变性,类似的研究也发现纤维状PS-MPs(10μg㊃L-1)暴露成年斑马鱼21d后,使其肠道产生轻微空泡化变性[27]㊂本研究联合暴露中,MPs-L+OTC组和MPs-H+OTC组肠道中部分淋巴细胞轻微向游离面游走,空泡化变性,肠上皮细胞轻微缺失,固有膜结缔组织疏松,表明OTC与PS-MPs复合暴露加剧了黄颡鱼幼鱼的肠道损伤㊂氧化应激酶可以反映鱼体对外部刺激的反应及其自由基新陈代谢的状态[39]㊂抗氧化酶(包括SOD 和CAT)是对抗生物体中自由基的酶防御机制的第一道防线[40]㊂本实验中,OTC单独组(500ng㊃L-1)对黄颡鱼幼鱼肠道氧化应激酶活性无显著性影响㊂类似研究表明50μg㊃L-1的OTC暴露斑马鱼仔鱼48h后,对SOD和CAT的活性无显著性影响[41]㊂本研究中,MPs-H组中黄颡鱼幼鱼肠道SOD和CAT活性显著升高㊂这一结果与先前的研究类似, PS-MPs作为激活剂能促进体内抗氧化酶(SOD和CAT)的分泌,在这个过程中提高了鱼类清除自由基和减少过氧化氢的能力[39],PS-MPs(5μm,1000μg㊃L-1)暴露斑马鱼21d显著增加SOD和CAT活性[42]㊂本研究MPs-H+OTC组与MPs-H组相比,显著加剧了黄颡鱼幼鱼肠道SOD和CAT活性的升高㊂表明1000μg㊃L-1PS-MPs显著增加了黄颡鱼幼鱼肠道抗氧化能力,而1000μg㊃L-1PS-MPs和500ng㊃L-1OTC复合暴露会给黄颡鱼幼鱼肠道氧化应激抵抗力带来额外的压力,增强对其SOD和CAT活性的促进作用㊂而在肠道微生物与SOD的相关性分析中,鲸杆菌属和SOD呈显著正相关,在MPs-H+OTC组中,PS-MPs与OTC可能通过黄颡鱼幼鱼肠道内鲸杆菌属的显著上升影响其SOD活性的升高㊂鱼类消化酶活性能够直接反应鱼类本身摄食以及消化情况,消化酶活性越高,鱼的生长情况越好[43]㊂本实验中,OTC对黄颡鱼幼鱼肠道淀粉酶(AMS)㊁脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶(TRS)活性无显著影响㊂这与肖亮[44]的发现类似,250mg㊃kg-1OTC 饲料喂养异育银鲫28d对其肠道消化酶(AMS㊁LPS 和TRS)活性和生长均无显著影响㊂这表明OTC组肠道消化酶与生长指标结果是相符的㊂本研究中1000μg㊃L-1PS-MPs显著降低了黄颡鱼幼鱼肠道LPS和TRS的活性㊂据报道,PS-MPs进入鱼类肠道,会导致饱腹感,使获取的食物和能量减少,影响其消化性能,MPs浓度越高,对消化性能的抑制作用越大[45],类似研究中PS-MPs(32~40μm,1000μg㊃L-1)暴露孔雀鱼幼鱼28d,显著降低其肠道AMS㊁LPS和TRS活性[46]㊂消化酶在蛋白质㊁脂质和碳水化合物的水解中起着非常重要的作用,从而。
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第26卷第3期2006年3月生 态 学 报ACTA EC OLOGI CA SI NICA Vol .26,No .3Mar .,2006生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学研究进展戴家银,王建设(中国科学院动物研究所,北京 100080)基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向性资助项目(KSCX2-SW -128)收稿日期:2005-08-30;修订日期:2005-12-05作者简介:戴家银(1965～),男,安徽怀宁人,博士,研究员,主要从事生态毒理学和生物化学研究.E -mail :daijy @ioz .ac .cnFoundation item :The project was supported by the Innovation Project of Chines e Academy of Sciences (No .KSCX2-SW -128)Received date :2005-08-30;Accepted date :2005-12-05Biography :DAI Jia -Yin ,Ph .D .,Professor ,mainly engaged in ecotoxicology and biochemis try .E -mail :daijy @ioz .ac .cn摘要:将基因组学和蛋白质组学知识整合到生态毒理学中形成了生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学。
通过生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学的研究能够在基因组和蛋白质组水平更深入理解毒物的作用机制,寻找更敏感、有效的生物标记物,形成潜在的强有力的生态风险评价工具。
介绍了生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学的研究进展,以及DNA 芯片技术和2D -凝胶电泳技术在持久性有毒污染物的生态毒理学研究中的应用。
关键词:生态毒理基因组学;生态毒理蛋白质组学;DNA 芯片技术;2D -凝胶电泳;持久性有机污染物文章编号:1000-0933(2006)03-0930-05 中图分类号:X171 文献标识码:AProgress in ecotoxicogenomics and ecotoxicoproteomicsDAI Jia -Yin ,WANG Jian -She (Institut e of Zoology ,C hines e Acade my of Sci ence s ,Beijing 100080,C hina )..Acta Ecologica Sinica ,2006,26(3):930～934.Abstract :Ec otoxicogeno mics and ecotoxic oproteo mics are integration of genomics and proteomics into ec otoxicology .Ecotoxic ogenomics is defined as the study of gene and pr otein expr ession in non -target organisms that is impor tant in responses to environmental toxicant exposures .Ecotoxic ogenomic toolsmay provide us with a better mechanistic understanding of ec otoxicology ,and they are likely to provide a vital r ole in ecological risk assessment .Pr ogress in ec otoxicogenomics and ecotoxicoprote omics are discussed in this paper .DNA gene c hip and 2D -gel usually used in ecotoxicogeno mics and ecotoxicoproteomics ar e also e xpounded by exa mples .Key words :ec otoxicogeno mics ;ecotoxic oproteo mics ;D NA micr oarra y ;2D -gel ;persistent organic pollutants 随着生态学和环境科学的深入发展,生态毒理学已成为生态学和环境科学前沿研究领域,正从基因、蛋白质、器官和整体水平深入开展研究工作。
在人类基因组计划实施的短短几年间,以“组学(-omics )”构成的学科及其相关研究如雨后春笋般在生命科学界迅速蔓延、蓬勃发展。
在环境科学领域中也出现了环境基因组学(environmental genomics )、毒理基因组学(toxicogenomics )等学科。
Snape 等人[1～3]将基因组学知识整合到生态毒理学中,于2004年提出了“生态毒理基因组学(ecotoxicogenomics )”的概念,通过生态毒理基因组学研究确认一系列毒物效应基因,从而在基因组水平更深入理解毒物的作用机制,并在基因和蛋白质水平寻找更敏感、有效的生物标记物(biomarkers ),形成潜在的强有力的生态风险评价工具。
持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants ,POPs )是指能持久存在于环境中、通过食物链蓄积、逐级传递,经直接或间接途径进入人体的化学物质。
POPs 具有致癌、致畸、致突变性、内分泌干扰等毒作用。
POPs 对人体健康和生态环境带来的危害受到全社会的普遍关注,引起世界各国的决策者和科学家的高度重视,也成为环境科学和生态毒理学研究的热点课题之一[4,5]。
我国已于2001年5月签署了控制12种P OPs 对人类健康和环境造成威胁的国际公约《斯德哥尔摩公约》。
目前我国履行该国际公约面临着巨大的挑战,缺乏POPs 这类污染物的第一手资料,有关该类污染物对自然环境、生态系统和人类健康影响的基础研究薄弱[6,7]。
同时,一些未包括在公约12种POPs 之内的新的持久性有机污染物也引起各国科学家的注意,如阻燃剂多溴联苯醚(PBDEs ),全氟辛酸胺(PFOS )等,它们在生物体内的累积及其毒理研究也已成为迫切需要开展的工作[8,9]。
本文重点介绍了DNA 芯片技术和2D -凝胶电泳技术在持久性有机污染物的生态毒理研究中的应用。
阐述了生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学的研究进展,以期进一步提升我国生态毒理学研究水平。
1 生态毒理基因组学研究进展基因芯片(gene chip ),又称DNA 微阵列(microarray ),是由大量DNA 或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列,待检测样本的核酸序列可根据碱基互补配对的原理与芯片上相应探针分子结合。
经过标记的两等量不同RNA 样本同时与DNA 阵列杂交,可高通量、迅捷精确的比较两样本基因表达谱的差异。
利用DNA 微阵列技术,一个单一的毒理基因组分析就可能产生成千上万个数据。
通过检测哪些基因受到特殊化学污染物的影响,寻找同污染物密切相关的基因,用于研究污染物的毒作用机制。
通过分析不同污染物暴露的基因表达谱特征,确定不同污染物暴露的生物标志物,可实现对污染物毒性的早期预警。
通过比较新化学物和已知污染物暴露基因表达谱的变化,可在新化合物研发阶段比传统方法更早地了解该化学物的毒理以及潜在的副作用。
通过研究不同有毒污染物暴露所致特征性基因表达谱的改变(应答“指纹”),可快速确定环境污染物的性质并对其分类。
结合生物信息学可开发具有同各类污染物相关基因的新一代小型检测芯片,如“环境激素”芯片,用于检测专一性环境激素对生物的影响;“有毒污染物”芯片,专一检测水体中持久性有机污染物以及饮用水加氯消毒产生的痕量有毒物质。
Forrest 等人应用基因芯片技术和实时聚合酶链反应(RT -PCR )技术,在职业性接触苯的工人中检测了苯接触对外周血单核细胞基因表达的影响。
结果显示,CXCL16、ZNF331、JUN 和PF4等基因的表达发生特异性改变,这些基因可作为苯接触的潜在的生物标志物,为利用生物芯片技术检测苯暴露提供了重要信息[10]。
Wang 等人用全血总RNA 分析了锅炉制造工人职业接触金属烟雾前后的基因表达。
由于接触微粒而引起表达改变的基因与炎症反应、氧化应激、胞内信号转导、细胞周期和细胞凋亡密切相关[11]。
双氯醋酸(Dichloroacetic acid ,DC A )是自来水加氯消毒的副产物,能引起啮齿类动物的肝细胞癌变。
2003年,Thai 运用DNA 芯片技术对DCA 的致癌作用进行了研究。
基因表达谱分析显示24个基因表达改变,其中15个基因进一步经Northern 印迹证实。
在15个基因中,14个基因表达明显下调,包括细胞色素P4502C29(CYP 2C29)、CYP3A11、肝羧酸脂酶等。
另一个基因CYP2A4 5表达上调。
相应研究为快速分析水环境中微量有机物的毒性提供新的途径[12]。
日本学者Azumi 利用海鞘DNA 芯片,分析比较海鞘基因表达谱变化,据此推测海鞘暴露何种污染物并用来监测环境污染程度[13]。
该技术在环境保护和环境监测领域中具有广阔的应用前景。
Taroncher -Oldenburg 等应用70mer 的寡核苷酸芯片监测并量化环境氮循环中的功能基因多样性[14]。
2 生态毒理蛋白质组学的研究进展基因芯片技术对于揭示有毒污染物诱导的基因表达谱变化具有十分的重要意义。
但是在多数情况下,mR NA 与蛋白质的关系在结构上和动力学上是高度非线性的,mR NA 表达分析不能有效地预测有毒污染物与蛋白质的作用。
生态毒理蛋白质组学是从整体的蛋白质水平上,探讨生物在同毒物接触或环境胁迫下,细胞蛋白质的存在及其活动方式(蛋白质谱)的变化。
2D -凝胶电泳技术将蛋白质混合物在二维平面上充分展开,而基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI -TOF )和生物信息学相结合用于确定感兴趣蛋白斑点的性质特征,是目前蛋白质组学研究中最常用的方法。
将蛋白质组学的相关技术应用到生态毒理学中,可在蛋白质水平上认识外源性化学物的毒作用及其机制。
同时,与基因表达谱相类似,有毒污染物及其浓度变化所致细胞蛋白质谱改变的“指纹特征”,可作为有效表征污染物暴露的生物学标记物(图1)。
虹鳟暴露壬基酚、地亚农(diazinon )和烯虫磷(propetamphos )3种污染物,以及污水厂排放口和排放口上游9313期戴家银 等:生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学研究进展 图1 蛋白质谱的“指纹”特征Fig .1 Illus tration of protein expressi on signature (PES )参考点,21d 后取样分析腮的蛋白质谱变化。