ITC(等温滴定量热)培训仪器操作和疑难解答
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样品准备
配体 用透析液稀释一管含DMSO 的配体母液，然后…. 蛋白 在蛋白溶液中加入相应量的DMSO
46 / 29-0301-14 AA
从DMSO母液中准备配体
样品准备
5 mM 配体 （100% DMSO）
50 µl
950 µl
透析液
250 µM 配体 （5% DMSO）
47 / 29-0301-14 AA
• 如果配体太小无法透析，则先透析大分子然后用透析液溶解 配体
43 / 29-0301-14 AA
样品准备不佳导致数据不佳
样品准备
此处给出了透析前后的数据
2.5
大峰是由于缓冲液间的NaCl 浓 2.0 度差异所致
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
礳al/sec
w透ith析dia后lysis
透析前
without dialysis
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
上手实验
对羧基苯磺酰胺 （4-carboxybenzenesulfonomide, CBS）滴定 牛碳酸酐酶 II（bovin carbonic anhydrase II, BCA）
上手练习
33 / 29-0301-14 AA
目标
上手练习
•演示如何在MicroCal™ iTC200 system 或者 MicroCal™ Auto-iTC200 system 上设置和运行一个滴定实验
匹配蛋白溶液的DMSO浓度
样品准备
DMSO
50 µl
950 µl
25 µM 蛋白透析液
1 ml，23.75 µM 蛋白 （5% DMSO ）
48 / 29-0301-14 AA
DMSO 不匹配
样品准备
如果缓冲液不匹配，DMSO 稀释会产生大量的热
Buffer 滴定 buffer 5% DMSO 滴定 5% DMSO 5% DMSO 滴定 4.5% DMSO 5% DMSO 滴定 4 % DMSO
数据分析
40 / 29-0301-14 AA
样品准备
样品准备
实验优化
实验
数据分析
41 / 29-0301-14 AA
样品准备
1. 透析蛋白或者置换蛋白的缓冲液 2. 用 A280精确测量蛋白浓度 3. 确保蛋白和小分子溶液完全匹配
42 / 29-0301-14 AA
步骤 1: 透析
样品准备
• 样品池和进样针的缓冲液必须完全匹配。最好将大分子和配 体均透析到同一缓冲液中。
Estimated KD µM
<0.5 0.5-2 2-10 10-100 >100
[Protein] µM
冲液浓度直到配体不再改变 pH
50 / 29-0301-14 AA
选择缓冲液
样品准备
•ITC是强大的，几乎所有的缓冲液比如HEPES, PBS, glycine, acetate等均可用
•如需使用还原剂，最好使用
– TCEP （ Tris (2-carboxyethylphosphine) hydrochloride ） – β- 巯基乙醇（β-mercaptoethanol，BME)
•测定对羧基苯磺酰胺 (CBS) 和牛碳酸酐酶 (BCA) 在 PBS buffer, pH 7.4中相互作用的∆G, ∆H 和 T∆S
34 / 29-0301-14 AA
实验参数
上手实验
• 200 µM CBS 和 20 µM BCA II in PBS • 实验温度25 °C • 1 * 1 µl 注射，然后 12 * 3 µl 注射 • 注射持续 6s • 注射间隔150s • 参考功率10 µcals/sec • 搅拌速度 1000 rpm • 高反馈
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Time (min)
44 / 29-0301-14 AA
步骤 2: 准确测量蛋白和配体的浓度
样品准备
•应用 A280检测蛋白浓度 •尽量准确地称取配体。如果配体发光基团，使用UV吸收更好。
45 / 29-0301-14 AA
步骤 3: 匹配缓冲液
用MicroCal™ iTC200 和 MicroCal™ AutoiTC200 获取高质量数据
目标
• 列举为取得高质量数据所需的操作步骤 • 演示样品准备时遵循一些简单的规则的益处 • 举例演示如何优化实验
39 / 29-030Biblioteka Baidu-14 AA
取得优质ITC 数据的四个关键步骤
样品准备
实验优化
实验
51 / 29-0301-14 AA
实验
样品准备
实验优化
实验
数据分析
52 / 29-0301-14 AA
清洁样品池
实验
µ cal/sec
11.00 10.50 10.00
9.50 9.00 8.50 8.00
0.00
用20% Contrad™ (14% Decon™) 和水冲洗
10.00
20.00
0.5 mcal/sec
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
Time (min)
49 / 29-0301-14 AA
pH 不匹配
样品准备
•使用高浓度配体时，i.e. mM 级或以上，可能出现pH 不匹配 •为了防止这个；用酸或碱滴定回要求的 pH， 同时/或者提高缓
Time (min)
积分后数据
0.0 -2.0 -4.0 -6.0 -8.0 -10.0 -12.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Molar Ratio
36 / 29-0301-14 AA
前往实验室
上手实验 按照实验手册指示进行实验
37 / 29-0301-14 AA
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
35 / 29-0301-14 AA
µ cal/sec kcal mol-1 of injectant
预计的结果
上手实验
原始数据
10.90
10.80
10.70
10.60
10.50
10.40
10.30 0.00
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
30.00
Time (min)
40.00
50.00
53 / 29-0301-14 AA
实验设置和关键问题
实验
•需要多少样品? •什么是理想的运行参数? •该设置什么样的对照实验?
54 / 29-0301-14 AA
需要多少样品?
实验
你知道 KD?
是 按照表格进行
No 尝试20 µM 蛋白和 200 µM 配体
配体 用透析液稀释一管含DMSO 的配体母液，然后…. 蛋白 在蛋白溶液中加入相应量的DMSO
46 / 29-0301-14 AA
从DMSO母液中准备配体
样品准备
5 mM 配体 （100% DMSO）
50 µl
950 µl
透析液
250 µM 配体 （5% DMSO）
47 / 29-0301-14 AA
• 如果配体太小无法透析，则先透析大分子然后用透析液溶解 配体
43 / 29-0301-14 AA
样品准备不佳导致数据不佳
样品准备
此处给出了透析前后的数据
2.5
大峰是由于缓冲液间的NaCl 浓 2.0 度差异所致
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
礳al/sec
w透ith析dia后lysis
透析前
without dialysis
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
上手实验
对羧基苯磺酰胺 （4-carboxybenzenesulfonomide, CBS）滴定 牛碳酸酐酶 II（bovin carbonic anhydrase II, BCA）
上手练习
33 / 29-0301-14 AA
目标
上手练习
•演示如何在MicroCal™ iTC200 system 或者 MicroCal™ Auto-iTC200 system 上设置和运行一个滴定实验
匹配蛋白溶液的DMSO浓度
样品准备
DMSO
50 µl
950 µl
25 µM 蛋白透析液
1 ml，23.75 µM 蛋白 （5% DMSO ）
48 / 29-0301-14 AA
DMSO 不匹配
样品准备
如果缓冲液不匹配，DMSO 稀释会产生大量的热
Buffer 滴定 buffer 5% DMSO 滴定 5% DMSO 5% DMSO 滴定 4.5% DMSO 5% DMSO 滴定 4 % DMSO
数据分析
40 / 29-0301-14 AA
样品准备
样品准备
实验优化
实验
数据分析
41 / 29-0301-14 AA
样品准备
1. 透析蛋白或者置换蛋白的缓冲液 2. 用 A280精确测量蛋白浓度 3. 确保蛋白和小分子溶液完全匹配
42 / 29-0301-14 AA
步骤 1: 透析
样品准备
• 样品池和进样针的缓冲液必须完全匹配。最好将大分子和配 体均透析到同一缓冲液中。
Estimated KD µM
<0.5 0.5-2 2-10 10-100 >100
[Protein] µM
冲液浓度直到配体不再改变 pH
50 / 29-0301-14 AA
选择缓冲液
样品准备
•ITC是强大的，几乎所有的缓冲液比如HEPES, PBS, glycine, acetate等均可用
•如需使用还原剂，最好使用
– TCEP （ Tris (2-carboxyethylphosphine) hydrochloride ） – β- 巯基乙醇（β-mercaptoethanol，BME)
•测定对羧基苯磺酰胺 (CBS) 和牛碳酸酐酶 (BCA) 在 PBS buffer, pH 7.4中相互作用的∆G, ∆H 和 T∆S
34 / 29-0301-14 AA
实验参数
上手实验
• 200 µM CBS 和 20 µM BCA II in PBS • 实验温度25 °C • 1 * 1 µl 注射，然后 12 * 3 µl 注射 • 注射持续 6s • 注射间隔150s • 参考功率10 µcals/sec • 搅拌速度 1000 rpm • 高反馈
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Time (min)
44 / 29-0301-14 AA
步骤 2: 准确测量蛋白和配体的浓度
样品准备
•应用 A280检测蛋白浓度 •尽量准确地称取配体。如果配体发光基团，使用UV吸收更好。
45 / 29-0301-14 AA
步骤 3: 匹配缓冲液
用MicroCal™ iTC200 和 MicroCal™ AutoiTC200 获取高质量数据
目标
• 列举为取得高质量数据所需的操作步骤 • 演示样品准备时遵循一些简单的规则的益处 • 举例演示如何优化实验
39 / 29-030Biblioteka Baidu-14 AA
取得优质ITC 数据的四个关键步骤
样品准备
实验优化
实验
51 / 29-0301-14 AA
实验
样品准备
实验优化
实验
数据分析
52 / 29-0301-14 AA
清洁样品池
实验
µ cal/sec
11.00 10.50 10.00
9.50 9.00 8.50 8.00
0.00
用20% Contrad™ (14% Decon™) 和水冲洗
10.00
20.00
0.5 mcal/sec
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
Time (min)
49 / 29-0301-14 AA
pH 不匹配
样品准备
•使用高浓度配体时，i.e. mM 级或以上，可能出现pH 不匹配 •为了防止这个；用酸或碱滴定回要求的 pH， 同时/或者提高缓
Time (min)
积分后数据
0.0 -2.0 -4.0 -6.0 -8.0 -10.0 -12.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Molar Ratio
36 / 29-0301-14 AA
前往实验室
上手实验 按照实验手册指示进行实验
37 / 29-0301-14 AA
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
35 / 29-0301-14 AA
µ cal/sec kcal mol-1 of injectant
预计的结果
上手实验
原始数据
10.90
10.80
10.70
10.60
10.50
10.40
10.30 0.00
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
30.00
Time (min)
40.00
50.00
53 / 29-0301-14 AA
实验设置和关键问题
实验
•需要多少样品? •什么是理想的运行参数? •该设置什么样的对照实验?
54 / 29-0301-14 AA
需要多少样品?
实验
你知道 KD?
是 按照表格进行
No 尝试20 µM 蛋白和 200 µM 配体