X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构

1.光的衍射现象
‘光线’拐弯了！
S
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衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强 不均匀 分布的现象
当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就 发生明显的衍射现象．如果缝很宽，其宽度远大于波 长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象 就很不明显了．
E S
E S
惠更斯—菲涅耳原理
惠更斯：光波阵面
rometry, DXMS • 生物玻璃bioglass
边界 硬度 脱水 溶解性 偏光性 染色性 漂浮性
（4）晶体的初步鉴定
小分子晶体
蛋白质晶体
完整，漂亮
常不完整，易出现多晶
偏硬，易碎成2瓣或几瓣 偏软，易碎成粉
不变化
因脱水而变坏
慢
快
强
相对弱
弱
强
下沉
漂浮
（5）衍射数据收集
• 晶体的处理：低温液氮气冷流技术 • 数据收集仪：底片、面探测器
缺点 o 存在“化学雾”背景和X射线散射背景 o 费时、费力
计数管（四圆衍射仪）
• 将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后再转换成数字存入计算机随时调用 • 逐点收集数据 • 优缺点与底片相反
面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪
Smart CCD Overview
SMART APEX-CCD探 测器
小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六 面体。
单位平行六面体，a、b、c 、、、 是表征它本身形状、 大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。
c
b
a
单位平行六面体参数
单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角＝坐标轴之间交角。 a、b、c ＝轴单位。
a、b、c、、、 关系有七种情况，与单位平行六面体七种格 子相对应。
感谢下 载
猪胰岛素(蛋白质编号4ins)的两条小链
2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72Å）Nature, 2004, Mar.
LHC-II是绿色植物中含量最丰富的主要捕光复合物，这种复杂的分子体系 镶嵌在生物膜中，具有很强的疏水性，难以分离和结晶。对其晶体结构的 测定是国际公认的高难课题，也是一个国家结构生物学研究水平的重要标 志。03年利用北京同步辐射实验室生物大分子晶体学线站获得了该晶体的 高分辨率衍射数据，最终获得2.72Å分辨率的晶体结构。
• 为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器 。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像 重建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也就是已被广泛应用的CT。
X射线与诺贝尔奖—物理学奖
• 伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 • 1903 年诺贝尔物理学奖。 • 1906 年的诺贝尔物理学奖。 • 劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。 • 英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。 • 英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。 • 瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。 • 美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。 • 前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖; • 美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖; • 瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。
面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪
• 金属丝构成的面板，可同时多点收集 • 将X射线光子强度转换为电信号 • 集计数管的精确和底片的多点收集效率
图像板image plate
• 面探测器的改进 • 由化学材料构成，整块板子密度一致 • 高分辨率 • 可见光下可测量 • 集底片和面探测器的优点于一身
蛋白质结构测定
2011-3-3
蛋白质三维结构测定方法及数量
蛋白质三维结构测定年增长图
第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定
• 原理
• 基本过程
• 优缺点
• 应用实例
一、相关原理
• 光的衍射现象 • X射线的发现及应用 • 本质的争论 • X射线衍射的发现 • 晶体学基础知识 • X射线晶体衍射
（6）数据分析
• 电子密度修饰 • 电子密度图诠释 • 结构模型精化
数据处理软件：Denzo, Scalepack
三、X射线晶体结构测定优点
• 分辨率高 • 不损伤样品 • 无污染 • 相对快捷 • 能得到晶体完整性的大量信息
四、X射线晶体结构测定存在问题
• 晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象； • 很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈） • X射线晶体衍射的工作流程较长。
• 晶胞(Unit cell)
✓ 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。
✓ 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 • 选择平行六面体的原则：
• ①所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 • ② 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 • ③ 所选平行六面体之体积应最小。 • ④ 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距
3.X射线本质的争论
X射线本质的争论--波动说
巴克拉： X射线波动性 标识谱线：不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射 一种硬度的X射线，当原子量增大时，标识X射线的穿透本 领会随着增大。这说明X射线具有标识特定元素的特性。
X射线本质的争论—微粒说
布拉克父子 X射线微粒论者
粒子具有旋转性
4.X射线衍射
体结构作为研究结果的一种分析方法。
5.X射线的获得：
X射线管
激光等离子体
同步辐射
X射线激光
• 什么是晶体 • 晶体的周期排布 • 晶体的对称性
6.晶பைடு நூலகம்基础
3.1什么是晶体
• 固体物质 • 晶体
• 相当罕见的东西？
• 非晶体
• 晶体(Crystal )
✓ 指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复 排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。
F—— 面心格子（角顶、每个面）
结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说， 格子的种类有、且只有十四种。
衍射方向
二、X射线晶体结构测定基本过程
①蛋白质获取（提纯） ②晶体生长并经冷冻技术处理 ③重原子衍生物制备 ④衍射数据收集 ⑤衍生数据分析和改进 ⑥结构模型的获取（包括修正）
（2）晶体生长过程及影响因素
上每一点都可以看作 新的子波源，以后任 意时刻，这些子波的 包迹就是该时刻的波 阵面。
——1690年
解释不了光强分布！
菲涅耳补充：从同
一波阵面上各点发出 的子波是相干波。
——1818年
2. X射线的发现历程及应用
• 失之交臂 • 1836 法拉第 发现阴极射线 • 1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干版和光片有问题？ • 1890 古德斯柏德 洗出了一张X射线的透视底片 照片的冲洗药水或冲洗技术
• 晶核（尽量少） • 微晶（可用作晶种） • 晶体在数小时至数月后出现 • 2个问题： ① 是盐晶吗？ ② 能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶）
（2）晶体生长过程及影响因素
• 影响因素
： ❖ 物理因素 温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂纯度、重力、外加物理场等 ： ❖ 生物化学因素 pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的类型和浓度等 ： ❖ 其他 溶液过饱和度、纯度等
• 发现X射线 • 本质的争论 • X射线衍射
2.X射线的发现及应用
• 1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。
伦琴夫人的手的X射线照片
X射线在医学上的应用
• 伦琴的新发现轰动了全世界, 不到三个月, 维也纳的一 家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此, X射线 拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。
化学奖
• 荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。 • 美国著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。 • 英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。 • 英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。 • 美国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。 • 英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。 • 英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖; • 美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖; • 1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。
Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at
五、应用实例
1.胰岛素
• 于1971年和1972年分别得到分辨率为
2.5埃和1.8埃的猪胰岛素晶体测定，
这是中国阐明的第一个蛋白质的三维
结构。
“中国蛋白质晶体学研究水平和世界发达 国家一样高！ 胰岛素晶体最好的电子密度图在北京，不 在牛津。” ——多萝西·霍奇金 ，1972
立方格子 a=b=c == =90o
三方格子
a=b=c == ≠90o，
60， 109o28'16 "
菱面体格子中α为特殊角度时，演变成的三种立方体格子
四方格子
a=b ≠ c == =90o
六方格子
a=b≠c ==90o =120o
正交格子
a ≠ b ≠ c == =90o
单斜格子
a ≠ b ≠ c = =90o ≠90o
三斜格子
a ≠b ≠c ≠ ≠ ≠ 90o
按结点位置，可有四种不同的类型： P—— 原始格子（角顶） C—— 底心格子（角顶、顶底面） I —— 体心格子（角顶、体心） F—— 面心格子（角顶、每个面）
P—— 原始格子（角顶）
C—— 底心格子（角顶、顶底面）
I —— 体心格子（角顶、体心）
衍射分析仪器的发展
• 射线种类：连续射线 特征射线 电子衍射 中子衍射
• 探测技术：胶片 闪烁体计数器（点） （IP）CCD探 测器（面）
图2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分）
*右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，β代表Kβ衍射
底片（外森堡相机、徘循相机）
• 优点： ✓ 多点同时收集 ✓ 容易保存 ✓ 价格便宜
发表于《Nature》2004年3月18日作为封面文章
Chang et al., Nature 428, 287 (2004)
意义：发现了膜蛋白 结晶的第三种类型， 提供了近3万个独立、 精确的原子坐标
复习思考题
1. 简述X射线晶体结构测定的基本过程。 2. 了解晶体鉴定的基本要点。 3. 熟悉X射线晶体结构测定的优缺点。
“经验” “机器人”
（3）结晶方法
• 批量结晶法 batch crystallization • 透射法 crystallization by dialysis • 液相扩散法 liquid diffusion • 气相扩散法vapor diffusion • 氢氘交换质谱技术 Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spect
晶体什么样（1）
晶体什么样（2）
晶体什么样（3）
晶体什么样（4）
2.晶体和点阵结构
• 晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成“点阵”来研究. • 一维周期性结构与直线点阵 • 二维周期性结构与平面点阵 • 三维周期性结构与空间点阵
一维周期性结构与直线点阵
二维周期性结构与平面点阵
三维周期性结构与空间点阵
X射线衍射的获得
• 波长范围：10—0.1埃 • 欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常
数恰是这样的线度 • 衍射波的两个基本特征—衍射线（束）在空间分布的方位（衍射
方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。
• X射线晶体结构分析？
✓ 使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶