第13章2-细胞增殖及其调控

都排列在纺锤体上了吗？任何一个着丝点没有正确连
断。
14
上页
下页
返回
结束
15
上页
下页
返回
结束
（三）细胞周期蛋白
cyclin 的种类繁多，目前从芽殖酵母、裂殖 酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种， 在脊椎动物中为A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、
H等。分别参与细胞周期中不同时相的调节。分
MPF = P34cdc2(CDK1)+Cyclin B
（催化亚单位） （调节亚单位）
上页
下页
返回
结束 8
上页
下页
返回
结束
MPF的生化成分：含有两个亚单位 MPF =Cdc2+cyclin （催化亚单位+调节亚单位）
上页
下页
返回
结束
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001
上页
下页
返回
结束
40
CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化 上页 下页 返回 结束 41
CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase
过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮 间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下 一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期 蛋白(cyclin)。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广 泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上 存在互补性。
上页
CDK4结合，抑制cyclin - CDK复合物的蛋白
激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质
磷酸化受阻，细胞停留在G1期。
上页
下页
返回
结束
39
Fra Baidu bibliotek
此外P21cip1还可与DNA聚合酶δ亚单 位PCNA (proliferating cell nuclear antigen, PCNA )相互作用， 抑制DNA 复制，但不影响DNA修复。
"for their discoveries of key regulators of the cell cycle"
Leland Hartwell
Timothy Hunt 上页 下页
Paul Nurse 返回 结束 11
（二）细胞周期的检验点
1989年，Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实
CDK1 CDK2
CDK3 CDK4 CDK5 CDK6 CDK7
* P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性 上页 下页 返回 结束
30
1． Cyclin的结合是CDK激活的第一步
CDK 活 性 的 最 初 调 节 者 是 cyclin 亚 单 位 。 Cyclin 与相应的 CDK 结合后，引起 CDK 空间构象 改变，暴露其催化亚基。各种细胞周期蛋白程序
上页
下页
返回
结束
23
G2/M期 cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷 酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷 酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。
上页
下页
返回
结束
24
M期 在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知 的途径，激活后期促进因子APC (anaphase promoting complex) ，负责将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被 蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。
上页
下页
返回
结束
脊椎动物的CDK
CDK 结合的相应cyclin CyclinA,B CyclinA CyclinD1,D2,D3 CyclinE CyclinD1,D2,D3 P35*, CyclinD1,D2,D3 CyclinD1 CyclinH, P36* 作用的细胞周期 G2/M转换； M早期 S期 G1期 G1/S 转换 G1期 G0/G1转换、G1期 神经纤维的磷酸化、G1期 G0/G1转换 活化CDK
为G1型、G1/S型S型和M型4类。
上页
下页
返回
结束
17
人类细胞周期蛋白线性结构示意图 实心方框代表“cyclin box ”， 方框代表“destruction box” 圆形框代表PEST 上页 序列 下页 返回
结束
18
cyclin box：各类周期蛋白均含有一段约100个
氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclin
19
G1期 细胞在生长因子的刺激下， G1期cyclin D表达，并与CDK4、 CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷 酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子 E2F，促进许多基因的转录。
上页
下页
返回
结束
20
Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F 上页 下页 返回 结束
21
上页
下页
化的合成和降解保证各对应 CDK适时的活化，维
持细胞周期的正确时序。
上页
下页
返回
结束
31
细胞周期各时相MPF、P34、P56的变化
2．CDK的磷酸化与去磷酸化
以P34cdc2 (CDK1)为例，如果对P34cdc2磷酸化 作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和 负向的控制。完整的 P34cdc2-cyclin 复合物需要磷
即促细胞分裂因子 (mitosis- promoting factor ， MPF) 。
上页
下页
返回
结束 3
M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集 染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。
G1期PCC为单线状，因DNA未复制。
上页
下页
返回
结束
25
哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用 上页 下页 返回 结束
26
（四）CDK及其调控
CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin–
dependent kinase,CDK)，控制着细胞周期各期之
间的顺序转换。CDK是一组相关联的Ser/Thr蛋白
激酶。
上页
下页
返回
下页
返回
结束 7
4. MPF － P34cdc2－Cyclin ？？
1988年M. J. Lohka 纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由 34KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质
磷酸化。
1990 Paul Nurse进一步的实验证明P34实际上是 P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，对于 P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。从而将细胞周期 三个领域的研究联系在一起。
Cln 1、 2 CDK1(CDC28) Clb 5、 6 CDK1(CDC28)
CDK1(CDC2) Clb 1-4 CDK1(CDC28)
*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量 不同，但具有相同的功效。
上页 下页 返回 结束
酵母中细胞周期的进程主要由单一 的CDK（P34cdc2/ cdc28）所控制。多 细胞生物中，细胞周期各期之间的 转换需要不同的CDK。
上页
下页
返回
结束
35
P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所
必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKs
activiting kinase）应答Thr161的磷酸化，这
是另一种蛋白激酶CDK7-Cyclin H复合物。
当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又
失去激酶活性。
上页
下页
返回
结束
进一步研究发现：P34cdc2与P34cdc28是同源物，二者本
身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激 酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白 P56cdc13结合后才具有激酶活性。
上页
下页
返回
结束 6
3.cyclin
1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂
box)，介导周期蛋白与CDK (cyclin–dependent
kinase)结合。
Cyclin也含有降解盒（destruction box）或 PEST（脯氨酸－谷氨酸－丝氨酸－苏氨酸） 序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转
来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚
基的作用。
上页 下页 返回 结束
36
3．CDK抑制剂的作用
除了磷酸化／去磷酸化可以调节MPF活 性外，另有一类CDK抑制因子（CDC kinase inhibitor,CKI）可与CDK结合抑制其活性。
上页
下页
返回
结束
37
（1）Ink4(Inhibitor of cdk 4)：如 P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d， 专一地与CDK4、CDK6结合，阻止 CDK和cyclinD的结合。使细胞周期不
了细胞周期检验点（check point）的存在，并首次提出 检验点的概念。细胞周期的运行，是在一系列检验点的 严格检控下进行的，它保证前一个事件完成之后，才启 动下一个事件，检查点是细胞的错误监测机制。
上页
下页
返回
结束
12
主要检验点包括：
G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称
R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1
CELL CYCLE
上页
下页
返回
结束
细胞周期周而复始地进行着，这种周期性的
重复过程受到严格地控制，使得不同的细胞周期
事件在空间和时间上相互协调。
上页
下页
返回
结束
（一）研究背景 1. MPF 的发现及其作用
1960 年， Masui 和 Markert 研究爪蟾卵母细胞，提出
了 成 熟 卵 母 细 胞 中 存 在 一 种 促 成 熟 因 子 （ maturation promoting factor，MPF）。 Rao 和 Johnson(1970 、 1972 、 1974) 以 Hela 细胞为材 料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，
S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。
G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。
甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进 间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor， MPF)。
上页
下页
返回
结束
染色体超前凝集（PCC）
酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。
上页
下页
返回
结束
33
上页
下页
返回
结束
P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起 P34cdc2-cyclin复合物的失活，Weel是催化 Tyr15 磷酸化的激酶， Myt1 是 Thr14 磷酸 化的激酶；催化 Thr14 及 Tyr15 脱磷酸化 的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶 Cdc25蛋 白。
细胞融合与PCC(Premature chromosomal condense)
2.cdc基因
Leland Hartwell、 Paul Nurse分别以不同的酵母为实验
材料，发现了许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle
gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。 如何发现的？
返回
结束
G1 / S期 cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限 制点而进入S期。向细胞内注射CyclinE的抗体能使
细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的
参与。 S期 将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能
抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制 所必需的。
能从G1期的调控点进入到下一个时相。
上页
下页
返回
结束
38
（2）Cip/Kip：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、 P57kip2等，能与多种cyclin - CDK复合物包括 cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–
进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损 伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大 ？ S期检验点：DNA复制是否完成？
13
G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的
事件包括： 所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有
损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：所有染色体 接到纺锤体上，都会抑制APC活性，引起细胞周期中
结束
27
不同类型的CDK/cyclin复合体
脊椎动物 激酶复合体 Cyclin G1-CDK G1/S-CDK S-CDK M-CDK Cyclin D* Cyclin E Cyclin A Cyclin B CDK CDK4 、6 CDK2 CDK2 Cyclin Cln 3 CDK CDK1(CDC28) 芽殖酵母