PCR扩增基因

温度(℃) 温度(
94
循环1 循环1
94℃变性 94℃ 1min) (1min)
循环2 循环2
循环3 循环3
72 60 60 ℃退火 1min) (1min)
72 ℃延伸 1.5min) (1.5min)
时间(min) 时间(min)
PCR反应的温度循环周期 PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性, 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性 变性, 引物退火和反应延伸三个步骤完成的. 引物退火和反应延伸三个步骤完成的.如此周而复 重复进行, 始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求 为止. 为止.
1. PCR热循环仪 PCR热循环仪 2. 20L, 200L 吸头,200L,500L EP管, 20L, 吸头,200L, EP管, 10L, 50L,200L移液器 10L, 50L,200L移液器 3. PCR 电泳仪和电泳槽
(二)试剂
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 10×PCR Buffer; 10× Buffer; MgCl2, 25 mmol/L; mmol/L; dNTP( 其中包括dATP,dCTP,dGTP与dTTP; dNTP( 其中包括dATP,dCTP,dGTP与dTTP;每种 浓度均为10 浓度均为10 mmol/L ); 正向引物与反向引物(10 M/L); 正向引物与反向引物( M/L); Taq DNA聚合酶(1U/L); DNA聚合酶 1U/L); 聚合酶( DNA模板 小鼠基因组DNA, DNA模板 (小鼠基因组DNA,100ng/L , 反转录 cDNA); cDNA); ddH2O
加热
复 温
复 性
解除变性的条件后, 解除变性的条件后, 变 性的单链可以重新结合起来, 性的单链可以重新结合起来, 形成双链, 形成双链,其原有的特性和 活性可以恢复,这称DNA复性, DNA复性 活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火. 也叫退火.
【PCR
Байду номын сангаас
实验原理】
聚合酶链式反应(Polymerase 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 PCR)是 一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类 一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类 似于DNA的天然复制过程. 似于DNA的天然复制过程. 反应包括: 变性(Denature) 反应包括: 变性(Denature) , 退火(Anneal)和延伸 退火(Anneal)和延伸 (Anneal) (Extension)三个基本步骤. (Extension)三个基本步骤. 这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循 环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的 环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的 DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25～ DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25～35 轮循环就可使DNA扩增达10 轮循环就可使DNA扩增达106 倍.
PCR的产量 的产量
每一次循环后模板比前一次循环增加一倍. 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍. DNA产量以指数上升,n个循环后,达到 产量以指数上升, 个循环后 个循环后, 产量以指数上升 2n拷贝. 拷贝.
【目的基因】 基因名称:小鼠有丝分裂原激活蛋白激酶8 基因 基因名称:小鼠有丝分裂原激活蛋白激酶8
体内DNA的复制 体内DNA的复制
5' 3' 解旋酶类 dNTP DNA聚合酶 DNA聚合酶 RNA引物 RNA引物
复习
3' 5'
DNA的变性和复性 DNA的变性和复性
变 性
加热或强酸, 加热或强酸,碱性作用 DNA双螺旋的氢键断 可以使 DNA双螺旋的氢键断 双链解离,形成单链DNA, 裂,双链解离,形成单链DNA, DNA的变性 的变性. 这称为 DNA的变性.
(4)引物自身不应存在互补序列 )
(5)引物之间不应有互补性,尤其避免 端互补重 )引物之间不应有互补性,尤其避免3'端互补重 叠以防引物二聚体的形成 (6)引物 端不能进行任何修饰 )引物3'端不能进行任何修饰 端限定PCR产物的长度,对扩增特异性 产物的长度, (7)引物 端限定 )引物5'端限定 产物的长度 影响不大,可以被修饰. 影响不大,可以被修饰. (8)特异性 避免与非目的片段同源性过高 )特异性:避免与非目的片段同源性过高
7)循环次数 )
循环次数是25- 次 循环次数是 -35次. 循环次数过多,产生平台效应; 循环次数过多,产生平台效应;非特异性扩增产物增 加.
5. PCR反应常见问题 PCR反应常见问题
1. 没有任何产物: 没有任何产物:
模板太少,模板含有大量杂质(蛋白,酶抑制剂) 模板太少,模板含有大量杂质(蛋白,酶抑制剂) 酶失活或者忘记添加 引物设计, 引物设计,浓度 Mg2+浓度太低 变性时间太短,退火温度过高, 变性时间太短,退火温度过高,延伸时间太短等
2. 按下述程序进行PCR扩增: 按下述程序进行PCR扩增 扩增: 1) 94℃ 预变性 3 min; 94℃ min; 2) 94℃ 变性 1 min; 94℃ min; 3) 55℃ 退火 30 sec; 55℃ sec; 4) 72℃ 延伸 30 sec; 72℃ sec; 5) 重复步骤2~4, 34次; 重复步骤2~4, 34次; 6) 72℃ 延伸 5 min; 72℃ min; 7) 4 ℃, 3min.
代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物
3)PCR引物的设计原则 ) 引物的设计原则
(1)长度: )长度:
15-30个碱基, 一般为 -27个碱基 - 个碱基 一般为20- 个碱基 个碱基,
含量: - % (2)G+C含量:40-60% ) + 含量
(3)碱基分布: )碱基分布:
最好随机分布, 最好随机分布,不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在
4. 出现片状拖带: 出现片状拖带:
模板,酶,dNTP用量太大,循环次数过多 dNTP用量太大 用量太大, 模板,
6. PCR技术的类型与应用 技术的类型与应用
1)合成单链DNA: )合成单链 :
不对称PCR (Asymmetric PCR) 不对称
2)长片段目的基因的克隆: )长片段目的基因的克隆:
DNA 模板 (template) 引物 (primer) 4种脱氧核苷酸 (dNTP) 种脱氧核苷酸 ) DNA聚合酶 (Taq) 聚合酶 ) 反应缓冲液 Mg2+及某些使酶稳定的辅剂
1)DNA 模板 )
质量:要求有较高纯度的 质量:要求有较高纯度的DNA样品 样品 避免反复冻融, 避免反复冻融,防止降解 数量: 数量 25-100ng/20l
槽式 PCR
反向PCR 反向
4)基因定点诱变:在引物内引入变异 基因定点诱变: 5)基因表达分析 )
反转录PCR(Reverse transcription PCR ) ( 反转录 实时定量PCR(Real-time quantitative PCR) 实时定量 ( )
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制2%琼脂糖凝胶,取10 L扩增产物 配制2%琼脂糖凝胶,取10 L扩增产物 电泳.保持电压100V.电泳结束后,在 电泳.保持电压100V.电泳结束后,在 紫外灯下观察结果.
用琼脂糖凝胶电泳检测所扩增产物
4. PCR的反应体系中各组分作用 的反应体系中各组分作用
(Mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8 ) Mitogen8,
扩增部位: 扩增部位: 3'-UTR 扩增片段长度: 扩增片段长度:170 bp 模板DNA:小鼠基因组DNA,反转录cDNA 模板DNA:小鼠基因组DNA,反转录cDNA
【仪器耗材与试剂】 (一)仪器与耗材
6)缓冲液中的Mg2+ )缓冲液中的
作用: 作用 增强酶蛋白的稳定性,维持酶活性. 增强酶蛋白的稳定性,维持酶活性. 提高融合温度. 增加 dsDNA 的 Tm 值,提高融合温度. 形成可溶性复合物, 渗入. 与游离 dNTP 形成可溶性复合物,有利 dNTP 渗入. 浓度: 1.5-2.0 mmol/l 浓度
【实验步骤】
1. 在0.2 mL Eppendorff 管内配置20 L反应体系: 管内配置20 L反应体系 反应体系:
反应物 dd H2O PCR缓冲液 10× PCR缓冲液 (10×) MgCl2 (25 mmol/L) mmol/L) dNTP (10 mmol/L ) 正向引物 ( 10 M/L ) 反向引物 ( 10 M/L ) Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶 模板DNA 模板DNA 体积(L) 体积(L) 14(12) 14(12) 2 2 1.0 0.5 0.5 1 1
2)引物 )
定义: 定义: 与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的 的某个局域具有互补碱基特异性的 与模板 短的单链DNA片段. 片段. 短的单链 片段 分类: 分类:
锚定引物( ):T12-MN 锚定引物(tagged primer): ): 随机引物( ):6-9bp 随机引物(random primer): ): 简并引物( 简并引物(degenerated primer): 密码子简并性 )
或者套式PCR 长 PCR (Long PCR), 巢式 , 巢式PCR (nested PCR)或者套式 或者套式 重组PCR 重组
3)未知序列的扩增: )未知序列的扩增:
反向PCR (inverse PCR)或者染色体步移 (chromosome 反向 或者染色体步移 walking),锚定PCR(anchored PCR) ,锚定 ( )
5' 3' 5'
3' 5' 变性 3' 退火 5' 延伸
3'
变性,退火 变性,
延伸
PCR扩增原理 PCR扩增原理
PCR的三个热反应过程 的
Step1. 变性:加热,使模板DNA在高温下(94℃) 变性:加热,使模板DNA在高温下(94℃ 变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变 性阶段. Step2. 退火:溶液温度降至45～65℃,模板DNA 退火:溶液温度降至45～65℃,模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段. Step3. 延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA 延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA 聚合酶以单链为模板,利用引物的3 OH,以反应 聚合酶以单链为模板,利用引物的3'-OH,以反应 混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物, 混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物, 按5'-3'方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段. 方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段.
2. 产生多个条带: 产生多个条带:
引物与非目的片段存在互补,或者浓度太高 引物与非目的片段存在互补, Mg2+浓度太高 Mg2+浓度太高 酶用量太多 退火温度过低等
3.产生与目的片段长度相似的非目的片段: 3.产生与目的片段长度相似的非目的片段 产生与目的片段长度相似的非目的片段:
模板或者试剂不纯, 模板或者试剂不纯,有其他基因组污染
实验三 PCR扩增目的基因 PCR扩增目的基因
【实验目的】
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction). 聚合酶链式反应(Polymerase Reaction). 掌握PCR反应的基本原理与实验技术. 掌握PCR反应的基本原理与实验技术. 了解PCR的应用范围. 了解PCR的应用范围.
4)dNTP )
4种 dNTP 用量应均衡,否则会减少 Taq 酶合 种 用量应均衡, 成的忠实性,增加错配率. 成的忠实性,增加错配率.
5)DNA聚合酶 ) 聚合酶
最初的聚合酶 大肠杆菌DNA 聚合酶 klenow 片段 片段, 大肠杆菌 不耐热,每次加热变性后需重新补加. 不耐热,每次加热变性后需重新补加. 聚合温度偏低( ),产生非特异性扩增 聚合温度偏低(37 ℃ ),产生非特异性扩增 Taq DNA 聚合酶 从水生栖热菌中分离,可在70-75℃生长. 从水生栖热菌中分离,可在 ℃生长. Taq 酶扩增效率 600bp/min 酶扩增效率: 错配率: 1bp/4000bp (无3'-5'外切酶活性 错配率 无 外切酶活性) 外切酶活性