第十一章：植物体细胞无性系变异

C类基因突变，形成如右图的萼片 - 花瓣 - 萼片 - 花瓣的异常花。
（五）细胞质基因突变
离体培养条件可以使一些植物线粒体DNA环状构象和分子 结构发生变化，以及花药愈伤组织再生植株的叶绿体基因 部分丢失。
雄性不育烟草
小麦白化苗
（六）DNA多态性的变化
RAPD(random amplified polymorphic DNA)即随机扩增多 态性DNA标记，其基本原理与PCR技术一致。 RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行 多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, 以单个 人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引 物,在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增。 扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色 后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了 基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品 种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上
一步筛选法：筛选单基因突变细胞 多步筛选法：筛选多基因突变细胞
2. 负筛选法
先控制培养基营养成分，使正常型细胞生长，而突变的细胞处于抑 制不分裂状态，然后用一种能毒害细胞生长而对不分裂细胞无害的 药物淘汰正常细胞。
亚砷酸盐、某些核苷酸类似物
营养缺陷性突变体
3.“绿岛”法
在整体的植株水平上，用某 种化学物质作用于植株叶片， 使细胞发生突变，叶片局部 呈现绿色斑点，切下这部分 细胞进行组织培养，通过培 养细胞的再分化，使抗性细 胞分化成完整植株。
小麦的rRNA
亚麻的卫星DNA
(三）DNA甲基化
有些植物细胞经过离体培养后，基因组中的碱基会发 生某种化学修饰，如甲基化，从而影响基因的表达。 一般来说甲基化的程度与基因的表达呈负相关。 对DNA甲基化，一般采用CCGG位点的特异性限制内 切酶Hpa II/Msp I 来进行研究。Hpa II 识别幵切割未 甲基化的CCGG序列，但对甲基化的CG不起作用； Msp I 识别幵切割所有的CCGG序列。
Brettell 等（1986）从645株玉米杂种胚培养的再生植株中发现了一个 表现稳定的Adh1（乙醇脱氢酶）位点变异体。
由单碱基突变引起的：编码106位的赖氨酸（AAG）突变为终止密码子 （TAG）。
（二）DNA总量和DNA重复序列拷贝数的变异
在水稻中，用DNA重复序列进行的研究发现，一些重复 序列在组织培养中有显著的选择性扩增，愈伤组织的 DNA重复序列与叶片相比有5-70倍的拷贝数差异，而不 同品种叶子间的差异只有2-3倍。
第十一章：植物体细胞无性系变异
微生物：诱变育种、诱发遗传变异机理的 研究
高等植物：20世纪70年代后，生物技术发展使得能利用离 体培养的植物细胞，在 细胞水平上直接进行诱变和筛选。
第一节：体细胞无性系变异的来源与特征
一、体细胞无性变异的概念与应用
体细胞无性系：是指一切由植物的体细胞再生的植株。 经过组织培养循环出现的再生植株的变异称为体细胞无性 变异（stmaclonal variation). 体细胞无性变异的优点：诱变群体大，筛选方便；不受 季节限制效率高；试验重复性好，诱变条件可控；诱变 频率高变化幅度大；出现新的变异；在单细胞上进行避 免出现嵌合体；可以拓宽种质资源、加快育种进程。
高赖氨酸玉米、高甲硫氨酸沙打旺、芦笋等。
（二）抗病细胞突变体
在离体条件下直接以毒素为选择压力筛选抗病细胞突变体，由这些 突变细胞进一步再生出抗病植株。
马铃薯晚疫病
烟草野火病
（三）抗除草剂细胞突变体
用含除草剂的培养基进行筛选。
（四）抗逆细胞突变体
耐盐、耐高温、低温、耐干旱、耐重金属。
（五）单倍体细胞突变体 （六）其他性状的选择
存在于分化的细胞中
离体培养诱导：
嵌合体
影响变异的主要因素：
1. 外植体的种类和基因型、染色体水平、生理状态、不同培养器官
2. 培养基的成分
3. 继代培养时间
三、体细胞无性系变异的特征
1. 普遍性和多样性
不同植物都具有体细胞无性变异
变异涉及到农艺性状、生化特征、抗病 性和抗逆性、细胞遗传学和分子生物学 方面的变异。
植物细胞经过组培形成的愈伤组织往往存在RAPD. 说明DNA发生了组成的变化。
第三节：细胞突变体的诱导和筛选
植物的遗传改良、遗传研究和遗传资源的拓宽
一、细胞突变体筛选的意义
突变、重组
10-4
在细胞水平上可以通过选择压力，对培养细胞进行 定向诱发突变，使突变体的筛选在细胞水平上进行， 更为可控，诱变数量大，诱变几率高，重复性和稳 定性好。
（二）一般筛选程序
1. 确定选择剂的浓度
使90%以上培养物致死
2. 致死浓度筛选
3. 逐步筛选
三、细胞突变体的筛选与利用
（一）富含氨基酸和氨基酸类似物细胞突变体
大豆缺失甲硫氨酸、玉米缺失赖氨酸和色氨酸、小麦缺失赖氨 酸和苏氨酸、水稻缺失赖氨酸。 通过采用氨基酸和氨基酸类似物选择抗性细胞突变体，达到改 良人类食物营养品质需要的目的。 高浓度的氨基酸或氨基酸类似物可以通过反馈性抑制与 氨基酸生物合成的关键酶作用，而抑制植物细胞的正常 生长。
正常拟南芥花
A基因突变
B基因突变
C基因突变
决定被子植物花各个器官发育的基因共分为A、B、C三类。A类基 因决定花的萼片和花瓣；B类基因决定花的花瓣和雄蕊；C类基因 决定花的雄蕊和雌蕊。 A类基因突变，形成了如右图的雌蕊 - 雄蕊 - 雄蕊 - 雌蕊的异常花。 B类基因突变，形成如右图的萼片 - 萼片 - 雌蕊 - 雌蕊的异常花。
2. 可遗传性
可以通过有性生殖传递给后代。
外遗传（epigenetic): 性状的变异不是有DNA序列改变引起的植 物表型变异，而是特定培养条件使某些基因表达调控发生变 化所致，变异具有方向性，但不能通过有性生殖进行传递。
体细胞变异的植物
第二节：植物体细胞无性系变异机理
在培养植物细胞和再生植株中发现各种不同变异存在，其 中有些是可以遗传的变异，被称为体细胞无性系变异。
细胞水平的变异：
分子水平的变异
一、细胞无性系细胞水平的变异 （一）染色体数目变化 整倍体变异：姊妹染色体分离与细胞分裂不同步。
非整倍体变异：姊妹染色体进入相同的细胞。
1. 有丝分裂失败或进行无丝分裂
2. 核内有丝分裂，染色体复制而细胞幵不分裂
3. 核内DNA复制而染色体幵不复制，导致二分染色体和多 线染色体的形成，二者恢复为正常染色体则也可能形成多 倍体细胞。 4. 有丝分裂时出现多极纺锤体，分裂完成后产生3个以上细胞。
高产、品质好、生长势强等优良性状。
四、细胞突变体的鉴定
1. 形态学鉴定
2. 生物化学鉴定
蛋白质水平、酶活性
3. 细胞学分析
核型、减数分裂染色体行为、染色体数目
4. 分子水平检测
RFLP：限制性酶切片段多态性 RAPD: 随机扩增DNA多态性 AFLP：的思考题。
缺点：畸变率高、依赖于基因型、变异幵不总是稳定和遗传。
拓宽遗传资源，进行遗传改良
海雀稗体细胞耐寒突变体筛选 在山东省潍坊地区，海雀稗原始品种受冻害 致死，耐寒突变体材料能安全越冬（绿化）。
遗传学研究、发育生物学研究、生化代谢途径研究。
二、体细胞无性系变异的来源及影响变异的主要因素
3
外植体来源： 嵌合体
抗病性、抗逆性、抗除草剂、抗氨基酸和氨基酸类似物突变体。
二、细胞突变体筛选的原理
筛选的原理建立在有区别地杀死正常型细胞的基础上。 正筛选法、负筛选法、“绿岛”法
（一）筛选原理 1. 正筛选法 把细胞群体置于某种选择剂或选择条件下，细胞突 变体可以正常生长，正常型细胞不能生存而死亡，从而达到分离 目的的一种选择方法。
Plant Cell
Animal Cell
细胞有丝分裂过程
多倍体细胞的产生
（二）染色体结构变化
染色体断裂后经过修复和重新联结所形成的易位、倒位、 缺失和重复是造成无性系变异的真正原因。
二、分子水平的变化
（一）核基因突变
基因突变是指基因序列中碱基发生了改变，导致由一种 遗传状态转变为另一种遗传状态。
（四）转座子（transposible elements) 的活化
能够进行自我复制、在染色体上能够进行随机插入的DNA片段。 植物细胞组培过程中转座子可能被激活而发生转座和插入，引 起体细胞无性变异。
芭芭拉· 麦克林托克(McClintock B.，1902～ 1992) “转座因子”的概念麦克林托克早在1938年 就已提出 直到1976年，在美国冷泉港召开的“DNA插 入因子、质粒和游离基因”专题讨论会上， 与会科学家才明确地承认可以用麦克林托克 的术语“转座因子” 1983年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委 员会终于把这一年度的诺贝尔生理学或医学 奖授予了这位81岁高龄、不屈不挠的女科学 家，麦克林托克也由此成为遗传学研究领域 第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家。