第四章第二节植物体细胞无性系变异及突变体筛选

4、筛选有益突变进行品种改良
抗氨基酸突变体中氨基酸含量提高，可 以用于高品质育种的材料。 抗性突变体筛选可以获得抗性株系。
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物理诱变剂： 优点不需洗涤诱变剂，
缺点是需要特定的设备。UV是常用的诱变 因子；Γ射线等进行辐射处理诱变。
化学诱变剂：诱变处理后需要去除。
依据对DNA作用方式可分为三类： A. 与核酸碱基反应而且留在原位，从而引起DNA复 制时碱基配对的改变。如亚硝酸，硫酸二乙酯，EMS， 乙烯亚胺，亚硝基胍等；
选择相应的氨基酸生产过量的抗性突变体， 原理是关键酶对反馈抑制不敏感，超越常量的 合成对应氨基酸，或能减少或拒绝摄入氨基酸 或类似物，或能分解和转化而解毒。
B. 抗抗菌素药物突变体： 抗链霉素、卡那霉素和氯霉素等突变体， 多为细胞质遗传。 烟草细胞抗链霉素细胞系在（250500ug/ml）的链霉素培养基上再生植株表现 绿色。
C. 抗除草剂突变体：
培养在添加除草剂Picloram（4-氨基-3，5， 6三氯吡啶羧酸）培养基上的烟草中，分离出 抗除草剂突变体。 这类抗性属于单个显性或半显性突变遗传。
D. 抗病突变体：
烟草单倍体细胞经EMS处理后，培养在添 加蛋氨酸磺基圬（病毒素类似物）的培养基上， 由存活的细胞产生愈伤组织并分化成植株，对 病原体感染不敏感。
（2）悬浮细胞： 广泛采用的材料； 缺点是存在细胞聚集的现象影响诱变效果。 （3）原生质体：
是比较理想的诱变细胞来源。
缺点是植株再生困难。
3、突变的诱发：
（1）诱变因素：
可以采用物理或化学的方法进行诱变处理。如， 如EMS，NG(亚硝基胍)，和r射线等。 但诱变剂并非必需，许多突变体的获得不需添加诱 变剂，如抗菌素突变体的获得无需加入诱变剂，直接 利用选择剂进行筛选。
B. 天然碱基类似物，在核酸复制时，它们可掺入到 新合成的DNA分子中。如BUdR，8-氨基鸟嘌呤，2氨基嘌呤等；
C. 移码突变，如丫啶类物质等。
（2）诱变因子剂量与诱变方法选择： 诱变时期、诱变剂量、剂量率影响诱变效果。
诱变方法：较低剂量的诱变剂处理，或不同 剂量率的诱变剂处理，或采用复合诱变，两种 诱变剂同时使用；一种诱变剂多次使用；两种 诱变剂交替使用。
（1）整倍体变异 染色体自然加倍现象称为体细胞内
多倍化，可能是在有丝分裂过程中纺锤体合成受阻引起， 也可能是细胞质不分裂而形成多核细胞。 （2）非整倍体变异 非正倍体的出现多是由于多级纺 锤体出现、染色体不分离或滞后以及核碎裂等导致。
2. 染色体结构变异
包括染色体断裂后经过修复和重新连接形成的易位、 倒位、缺失和重复等结构变异。
(4) 表现型应能通过有性传递保持其特性。
2. 体细胞突变体的类型：
（1）营养缺陷型：
EMS(甲基磺酸乙酯) 处理烟草悬浮细胞诱导突 变，通过加入BUdR（5-溴脱氧尿苷）进行筛选。 已 选择出需要生物素、次黄嘌呤、对氨基苯甲 酸、赖氨酸、精氨酸及脯氨酸的六种营养缺陷型。
（2）抗性突变体： A. 抗氨基酸及类似物的突变体
（3）基因突变 包括核基因突变和细胞质基因突变。基因突
变分为隐形单基因或多基因突变和显性单基因或多基因突变。
（4）转座因子活化 转座因子是指能在基因组中移动和修
饰基因表达的DNA序列。转座因子插入到新的基因位点引起邻 近基因转录特性不稳定地抑制或修饰，转座作用可可以造成染 色体断裂、染色体缺失、重复、倒位和易位，而引起性状变异。 转座子激活也是体细胞无性系变异的主要原因之一。
当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂。 诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变 剂的作用。 诱变处理的另一种方法是，先在植株水平 上进行诱变处理，再在组织培养中筛选．如抗 除草剂突变体的获得。
4、突变体的选择：
（1）正选择法：直接选择法，突变细胞能够 在有毒或有害培养基上生长。抗性突变体， 激素自养型突变体等。
第二节 植物体细胞无性系变异及突变体筛选
将植物外植体在组织培养过程中，由于受到非生 物因子的诱导发生变异，进而导致再生植株发生遗 传变异的现象称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。
植物体细胞无性系变异现象是植物组织培养中的 普遍现象。并可产生有益变异性状，对品种改良具 有重要意义，已成为植物种质资源创新和品种选育 的有效途径。
（1）培养基成分和培养条件：
植物激素和生长调节剂是诱导体细胞无性系变异的重要原因 之一，培养基中含有多种激素时，其诱变率大于单一激素。 生长素既能促进多倍体细胞分裂，又能诱导多倍体，尤其是2， 4-D具有更强的诱变作用。
此外，高温、低温等培养条件也能促进染色体变异。部分植物 细胞悬浮培养比固体培养易变异。
六、突变体的利用：理论研究和品种改良方 面应用。 1. 生化代谢途径的研究； 营养缺陷型突变体研究，如烟草硝酸还原 酶突变体研究。
2、植物细胞遗传操作中的选择标记 体细胞杂交中作为选择标记，硝酸还原酶 细胞突变体及激素自养型突变体的利用。
3、基因突变位点的分析： 硝酸还原酶cnx和nia突变体Biblioteka Baidu胞融合后， 恢复硝酸还原酶活性表明二者突变位点不 同。
（4）母本植株的遗传状态：
不同物种再生植株变异率存在差异，同意物种不同品种 无性系变异率也有差别，同一物种多倍体变异率高于二倍 体。同一植株不同外植体变异率也存在差异。
三、体细胞突变体的特征和类型： 1. 特征：
(1) 突变发生的频率较低；
(2) 突变随机发生具有偶然性；
(3) 突变的表型在没有选择压力的条件下仍然稳 定；
一、体细胞无性系变异的广泛性 体细胞无性系变异主要表现：
(1) 植株外部形态变异，如株高、叶形、叶色等； (2) 育性上的变异； (3) 生长势上的变异； (4) 抗性变异； (5) 某些酶及同工酶变化；
(6) 次生代谢物的差异。
二、植物体细胞无性系变异的来源 1.源于外植体预先存在的变异 所用外植体体内存在变异细胞，由变异细胞再生 的植株可能为变异植株。 2. 离体培养诱导的变异： 植物组织培养本身对植物细胞产生一种胁迫作用， 从而诱发植物细胞发生可遗传变异和表观遗传变异 （epigenetic variation）。表观遗传变异是指不是由 DNA序列改变而引起的植株表型变异。
（2）负选择法： 采用某一非允许条件的培养基，使突变体 不能生长，而野生型能够生长，然后添加一 负选择剂，杀死生长细胞，而不能杀死不生 长的突变细胞，而保留下来受到选择。
（3）突变体鉴定： 细胞从选择性培养基转移到非选挥性培养基 上快速生长，当细胞团达到足够大时再转移到 选择性培养基上，然后再转移到植株分化培养 基上(非选择性培养基)，可在植株水平上检测 突变的表达。
(5) DNA甲基化 甲基化是指DNA复制后，在DNA甲基化酶
的催化下，将S-腺苷酰甲硫氨酸（SAM）上的甲基转移到 DNA分子的胞嘧啶碱基上的DNA修饰过程。当一些基因的某 些位置甲基化后，其基因表现为不活跃的非表达基因；去甲基 化后，则活跃表达。组织培养诱发的突变直接或间接与DNA甲 基化状态改变有关。
（2）植株再生途径：
体细胞胚胎发生途径遗传稳定性优于器官发生途径，尤其是 经历脱分化形成愈伤组织的间接器官发生途径变异频率较高。
（3）培养时间和继代频率：
继代培养时间越长，变异率越高。如香蕉茎尖繁殖经过 5、 7、9、11次继代培养，体细胞无性系变异率分别为1.3%、 1.3%、2.9%、3.8%。
五、体细胞突变体的诱发和筛选： 1、材料的选择： 选择原则：避免采用不能再生或难以再生的材 料；要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导。 要选择生长速度快的细胞。
2、细胞的来源： 愈伤组织、悬浮培养细胞和原 生质体。 （1）愈伤组织：
优点：取材方便
缺点：生长较悬浮细胞慢； 接触选择剂不均匀；聚集体较大， 抗性细胞不易正常生长；物理或 化学诱变作用不均一。
E. 其他突变体： 抗核酸碱基类似物的突变体体；碳源利 用突变体；激素自养型突变体；温度敏感突 变体；耐盐、耐早等环境胁迫的突变体等。
四、体细胞无性系变异的遗传学基础：
体细胞无性系变异具有其遗传基础，表现在染色体结构和 数量的变异、基因突变、扩增、丢失、重排和转座子激活等。
1.染色体数目变异
体细胞培养中产生的染色体数目变异主要源自有丝分裂过 程中纺锤体的异常。在细胞分裂的后期，不同程度的纺锤体缺 失导致染色体不分离、移向多级、滞后或不聚集，最终产生变 异。