产NDM-1酶肺炎克雷伯菌的目前研究进展

产NDM-1酶肺炎克雷伯菌的目前研究进展陈玲　王红（首都医科大学附属北京友谊医院感染科　北京　100050） 【关键词】　NDM-1酶　肺炎克雷伯菌　耐药机制　抗生素治疗 自1940年代青霉素诞生以来，人类开始结束了对致病菌的束手无策，成就了医学上的一段光辉历史。

而此同时，抗生素与致病微生物之间的斗争也拉开了帷幕。

后来，“超级细菌”开始登上历史舞台，所谓的ES⁃KAPE微生物（屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属的首字母缩写）的出现，一次次给人类敲响了警钟。

“超级细菌”（super bug），亦可称多重耐药菌（mul⁃tiple resistant bacteria），通常指的是一种携带多个耐药基因的细菌，如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌等，它们都一度被称为超级细菌。

2008年分离出来的产NDM-1酶肺炎克雷伯菌标致着新一种“超级细菌”的诞生，在此菌株中，产NDM-1酶基因blaNDM位于细菌质粒中，携带此质粒的肺炎克雷伯菌具备对除多粘菌素和替加环素之外的几乎所有的抗生素（包括碳青霉烯类抗生素）耐药。

新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1），因其首次在印度的新德里发现而得名。

NDM-1酶共270个氨基酸，分子量约28kDa，氨基酸序列与目前已知的金属β-内酰胺酶（MBL）相比，一致性不足33%，其不同之处在于活性位点旁有独特的氨基酸残基和插入序列，同时可以更紧密的结合碳青霉烯类抗生素［1］。

本文就产NDM-1肺炎克雷伯菌研究进展作一简要论述。

1　NDM-1酶的特点及分布根据分子结构及功能分类，可将β-内酰胺酶（β-lactamases，BLA）分为，A~D4类，以A、C类最常见，B 类指金属β-内酰胺酶属。

新发现的NDM-1酶属于B 类β-内酰胺酶，由质粒介导的水解碳青霉烯类金属β-内酰胺酶，它能水解单环类以外的一大类β-内酰胺类抗生素，与离子螯合剂EDTA、巯基化合物及菲咯啉等络合剂结合后金属酶的活性可被抑制，使得抑菌圈增大，但常见的β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸、舒巴坦不能抑制其活性。

β-内酰胺酶耐药机制主要通过破坏抗生素的β-内酰胺环。

作用机制通常有两种途径：①大多数的β-内酰胺酶依赖丝氨酸，如A、C、D类均含有一个与底物结合活性位点，使β-内酰胺环开环致抗生素失活；②少数β-内酰胺酶（B类）依赖金属离子，如Zn2+，金属离子结合半胱氨酸残基或组氨酸或同时结合两者，再同抗生素上的羧基结合，而使抗生素失去抗菌作用。

新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1），为含270个氨基酸的单链多肽［2］。

分子量28kDa，等电点（pI）6.9。

通过氨基酸序列及空间结构比较，NDM-1酶与其他类金属酶的氨基酸序列的同源性低，常常<40%有时甚至<1%，最相似的金属酶MBLsVIM型（VIM-1/VIM-2）的氨基酸序列相似度也仅有34.2%［3］。

NDM-1酶水解谱的广泛性，可能与活性位点附近一些氨基酸残基有关（第162~166个残基，为NDM-1酶不同于其他金属酶的特有插入序列；此外，第222位氨基酸在NDM-1为络氨酸，而其他金属酶在此位为色氨酸）。

研究表明，金属酶的关键在于氨基酸残基，尤其是形成金属键的氨基酸残基高度保守，基本都有1个HXHXD......HZn2 +保守序列，NDM-1酶同样含有这个保守序列，但在NDM-1酶中，两个组氨酸残基中间是丙氨酸残基，这个差异通过改变酶的空间结构，从而增加酶的水解活性［4］。

酶的动力学研究结果显示，相比于VIM和IMP，NDM-1与头孢菌素类结合更紧密，特别是头孢呋辛，头孢噻肟，头孢噻吩（头孢噻吩）和青霉素。

但与碳青霉烯类抗生素结合紧密程度并不如VIM-1和IMP［1］。

Yong等［1］对blaNDM-1进行遗传学分析后，发现blaNDM-1存在于肺炎克雷伯菌（05-560）180kb的质粒中，此基因片段上游还可检测到其他多种耐药基因，如抗利福平、氯霉素、链霉素、磺胺类等，使得获得此类质粒的细菌具备耐受除多粘菌素和替加环素之外的几乎所有的抗生素。

通过进一步实验，发现该患者的粪便中，分离出含有blaNDM-1基因的大肠杆菌，存在于140kb的质粒中，这说明了携带blaNDM-1的质粒在同一患者不同细菌中可以发生菌种间转移接合。

可见，含有blaNDM-1的质粒可以穿梭于不同菌株之间，且blaNDM-1阳性的质粒大多数都可以进行基因快速转移，并在转移过程中发生重组［5］，而使不耐药菌株转变为多重耐药细菌。

所以，此类质粒若广泛在各种细菌内传播，对人类抗致病菌将是无比巨大的挑战。

继此之后，有研究报道，早在2006年的印度，已有万方数据产NDM-1细菌的散在分布［6］。

自印度新德里发现产NDM-1肺炎克雷伯菌以后，除了印度、巴尔干以外，英国、美国、南非、加拿大、澳大利亚、意大利、韩国、科威特、毛里求斯、摩洛哥、土耳其、日本等多个国家都相继出现产NDM-1肺炎克雷伯菌的相应报道。

甚至有报道，在欧洲曾出现产NDM-1酶肺炎克雷伯菌的暴发流行［7］。

产NDM-1酶的细菌更是在世界范围内广泛分布，如法国、日内瓦、挪威、瑞典、希腊、孟加拉国等。

目前在国外的报道中，产NDM-1酶细菌多为革兰阴性杆菌中，以肺炎克雷伯菌和大肠杆菌为主，免疫力低下、入住ICU、长期使用抗生素为其易感因素。

在中国大陆，2010年10月26日，中国疾病预防控制中心（CDC）对已收集的所有的菌株分析中，发现有3株产NDM-1型的耐碳青霉烯菌株：屎肠球菌2株［8］、鲍曼不动杆菌1株［9］。

迄今，台湾地区在收集近1年内肠杆菌株共4818例进行NDM-1酶的筛查，发现1例产NDM-1酶肺炎克雷伯菌和2例产NDM-1酶大肠杆菌，均无印度等外出旅游史［10］。

在中国大陆报道产NDM-1酶菌株主要为不动杆菌属，而肠杆菌属有产酸肺炎克雷伯菌1株、臭鼻克雷伯菌1株和肺炎克雷伯菌1株［11］。

邹明等［11］在重症肺炎合并中毒性心肌炎患儿的痰液标本中分离出中国大陆第一例产NDM-1酶肺炎克雷伯菌，该患儿及家庭成员均无印度等疫区旅游史，经过PCR扩增技术鉴定，显示此株肺炎克雷伯菌blaNDM基因序列与首例产NDM-1酶肺炎克雷伯菌的blaNDM-1基因序列完全一致，且对碳青霉烯类所有β-内酰胺酶类抗生素呈高水平耐药。

2　产NDM-1肺炎克雷伯菌的毒力及耐药机制肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，常存在于人类呼吸道、胃肠道，是除大肠杆菌外导致医源性感染的最重要条件致病菌。

对肺炎克雷伯菌的毒力，目前尚没有确切的研究，但肺炎克雷伯菌的荚膜血清型、脂多糖、铁清除系统和粘附作用都可以增加细菌的致病力，同时生物膜的产生及耐热性对肺炎克雷伯菌的致病性及耐药性有重要意义。

在动物小鼠模型中，通过对5种携带不同耐药基因的肺炎克雷伯菌的毒力研究，发现携带blaNDM -1耐药基因的肺炎克雷伯菌毒力最强，所以可以推测blaNDM-1基因的存在有增强肺炎克雷伯菌内在的致病力的潜能。

在目前抗菌药物大量运用的情况下，基于选择压力多重耐药的肺炎克雷伯菌不断出现，2010年中国临床分离菌耐药性监测（CHINET）的结果显示肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的泛耐药菌株呈上升的趋势。

对肺炎克雷伯菌的耐药机制研究主要集中于以下几种：产生抗菌药物水解酶、外膜渗透性障碍、靶位点改变、主动外排泵等机制。

产NDM-1酶肺炎克雷伯菌能够水解β内酰胺环结构，因此可使任何含β内酰胺环结构的药物失效，而目前最常用的抗生素，如青霉素和头孢菌素，头霉素类、硫霉素类等其他非典型β内酰胺类抗生素，都含β内酰胺环结构，所以携带NDM-1酶的细菌可以使几乎所有的抗生素失效。

在1989年，Stokes等提出基因元件-整合子这个概念。

而基因盒-整合子系统的正式提出是在1991年，它具有位点特异性重组功能，与细菌耐药性的产生与传播存在着很大的关系。

该系统包括3个部分：5'，3'端高度保守片段（CS）和其间的可变区，5'CS由整合酶（IntI）编码基因intI、启动子、基因重组位点att I构成；可变区含有1个或多个基因盒；3'CS因整合子种类不同而不同。

基因元件-整合子常位于染色体、质粒或转座子上，并可在其间移动。

整合子能够捕获外源基因，并使其转变为功能基因。

基因盒所含的基因主要为耐药基因，它是由整合子携带的最小的介导抗生素耐药的可移动基因实体，以I类整合子为主。

基因盒的表达依赖于整合子上的合适启动子，且整合以后就不能被切下来，这对细菌耐药性的传播和进化有着重要意义。

此次广泛流行的产NDM-1酶肺炎克雷伯菌，除了与NDM -1酶的水解β内酰胺环结构有关，可大胆推测blaNDM-1基因在不同菌种及菌株间的迅速传播与基因盒-整合子系统机制有着密切关系。

3　NDM-1酶的实验室诊断产NDM-1酶肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药，主要机制是由NDM-1酶介导，对于NDM-1酶的实验室诊断顺序主要为表型的筛查、表型确认和基因确定［12］。

在基因检测方面，采用blaNDM-1基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带balNDM -1基因。

有研究显示，在生物分离技术尚不够成熟或尚未普及情况下，快速合成阳性对照基因用于实时PCR 检测NDM-1基因可以增加检验的准确度和灵敏度［13］。

通过克隆的合成基因片段（TaqMan探针）检测临床菌株，可优化NDM-1的检测，此方法在测量每个DNA 标本的NDM-1基因的数量上具有很高的准确性［14］。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification technique）［15］，这种检测技术用时短、可以肉眼观察结果、特异性及准确性均较高，研究者建议在以后的基础实验研究、紧急检测、现场检测中都可以使用此方法快速检测NDM-1基因。

万方数据针对最初在美国发现的产NDM-1肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-2146），Leski等［16］研制了抗生素耐药基因芯片（antimicrobial resistance determinant microarray，ARDM），包括针对278种抗生素耐药基因的2240种DNA探针，囊括了12类抗生素（β-内酰胺类、氨基糖甙类、大环内酯类、喹若酮类、磺胺类等）。

对ATCC BAA-2146进行基因芯片测试时，发现广谱抗生素耐药基因，其中包括6种临床常见的抗生素耐药基因元素。

由于基因芯片的简便和囊括耐药基因较多，所以ARDM 是一个可用于检测耐药菌株的传播和进化，从某种程度上还可以了解到在肠杆菌株中接合转移的难易程度。

4　产NDM-1酶的传播方式最初，产NDM-1细菌个案报道中，通常都有相应的印度或巴基斯坦旅游史，但是随着对产NDM-1酶细菌广泛高度关注，世界各地报道产NDM-1细菌日趋增多，发现并非所有的病人都有疫区旅游史，有文献指出产NDM-1肺炎克雷伯菌的最初来源可能不止在印度［17］，所以推测在自然环境中本就存在着携带blaNDM -1质粒，且这种质粒可以在细菌种属间相互转合，而转合后含NDM-1质粒的稳定性在不同细菌是不一样的。