对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究进展

文章编号:167328640(2010)0120063204 中图分类号:R378.1 文献标识码:A

对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究进展

汤　瑾1

,　李　卿2

,　蒋燕群

1

(1.上海交通大学附属上海市第六人民医院检验科,上海200233;2.上海市临床检验中心,上海200126)

关键词:碳青霉烯酶;肺炎克雷伯菌;检测作者简介:汤　瑾,女,1975年生,学士,主管技师,主要从事细菌耐药监测及相关研究。通讯作者:蒋燕群,联系电话:02126436918128735。

碳青霉烯类抗菌药物在临床上可用于多重耐

药的细菌感染,随着临床上碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用,产生了对亚胺培南或美罗培南耐药的肠杆菌。至今为止对碳青霉烯类耐药的肠杆菌还比较少见,1998至2001年美国的net w ork 监测中没有发现此类细菌。调查了1996至2000年间24家美国医院分离的1123株肺炎克雷伯菌,只

找到了4株耐药菌株(在同一个中心)[1]

。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneum oniae carbapene mase ,KPC 酶)最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中被发现。从2000年以后,KPC 酶家族陆续在美国的新英格兰和亚特兰大地区被发现,主要在克雷伯菌属中,也在其他菌株中被发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感染菌,其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药给临床抗感染治疗带来了极大困难。

一、碳青霉烯酶的分类

碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β2内酰胺酶,包括Ambler 分子分

类为A 、B 、D 3类酶[2,3]

。A 类为丝氨酸酶,其活性部位具有丝氨酸结构,属于Bush 分群中的第2f 亚组。A 类碳青霉烯酶少见,包括阴沟肠杆菌(I M I 21和NMC 2A )、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC 2A 、S me 21、S me 22、S me 23、I M I 21酶,以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的KPC 21、

GES 22酶[4]

。这类酶都是青霉素酶,他们对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药,而对第3代头孢菌素通常敏感。三唑巴坦、克拉维酸可以抑制此类酶,但不被乙二胺四乙酸(E DT A )所抑制。

Amble 分类D 类为丝氨酸酶,属于Bush 分群中的第2d 亚组,其活性部位具有丝氨酸结构,由bla OXA 等位基因编码,仅见于不动杆菌。

Amble 分类B 类是金属酶,属于Bush 分类3组,是一种需金属离子发挥活性的β2内酰胺酶,由bla I M P 、bla V I M 、blaSP M 和blaGI M 编码,可被

EDT A 所抑制[2]

,染色体介导或质粒介导,存在于多种不同革兰阳性和革兰阴性细菌中。金属酶均可明显水解亚胺培南,能水解除单环类抗菌药物以外的绝大多数β2内酰胺类抗菌药物,但对于其他

β2内酰胺类抗菌药物的水解能力有较大差异[5]

。临床使用亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物大大增加,导致金属β2内酰胺酶产生率有不断上升的趋势。目前尚未开发出有效的金属酶抑制剂。

细菌对碳青酶烯类抗菌药物耐药除了产水解碳青霉烯类β2内酰胺酶外,耐药机制还可能涉及如下几个方面:(1)高产AmpC 酶伴膜孔蛋白Omp 缺失,如阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌。革兰阴性菌的细胞壁外膜的蛋白通道是药物进入细菌的重要途径,膜孔蛋白对β2内酰胺类抗菌药物的导入作用有其特异性,当某种膜孔蛋白表达减少或缺失时,相应的抗菌药物就不能进入细菌发挥作用;(2)青霉素结合蛋白改变。β2内酰胺类抗菌药物通过膜孔蛋白进入周质间隙,然后与青霉素结合蛋白结合而发挥抗菌作用,此蛋白发生结构变化,β2内酰胺类抗菌药物与之亲和力下降或不与其结合,则不能有效干扰细菌细胞壁的合成而产生耐药;(3)主动外排系统的活跃。细菌细胞内膜存在能量依赖性蛋白外排泵,通过主动外排作用将药物从菌体排出,使达到作用靶位的药量

明显减少,不足以发挥杀菌或抑菌作用[6,7]

。

二、KPC 酶的研究进展1.KPC 21酶　2001年有学者在美国北卡罗来纳州肺炎克雷伯菌中发现由质粒介导的KPC 21酶[8]

。耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性[最低抑菌浓度(M I C )均为16μg/mL ],当存在克拉维酸时,针对亚胺培南和美罗培南的β2内酰胺酶活性被抑制;对头孢菌素类抗菌药物和氨曲南也耐药。KPC 21基因由大约50kb 的非

结合性质粒携带。基因测序显示,核苷酸序列不同于基因库中已有的编码β2内酰胺类酶的基因。氨基酸序列分析显示,KPC21与来源于黏质沙雷菌S6的可水解碳青霉烯的β2内酰胺酶S me21有45%的同源性,其他3种A类碳青霉烯酶(Nmc2 A、I M I21、Se m21)间在核酸水平上相互的相似性>90%,说明KPC21酶可能具有与这3种密切相关的A类碳青霉烯酶不同的起源[8]。外膜蛋白分析表明,尽管存在OmpK36,但未检测出OmpK35和OmpK37的表达[8]。总之,KPC21酶是一种新的属于A类Bush2f组的可水解碳青霉烯的β2内酰胺酶,肺炎克雷伯菌1534的碳青霉烯耐药性主要由KPC21酶介导,孔蛋白表达的改变可能也起了某种作用。

2.KPC22酶　2002年报道,1998年在马里兰州一名4岁腹泻患儿粪便里分离出一株沙门菌(AM04707),出现了耐大多数β2内酰胺类抗菌药物和亚胺培南的表型,检测出KPC22酶[9]。2003年,国际癌症研究协会(I CARE)项目报道了在1998年纽约州医院发现一株产酸克雷伯菌(产酸克3127)产KPC22酶[10]。

KPC22酶与KPC21酶有一个氨基酸的改变, S174G,分类也属于A类Bush2f组。一个氨基酸的改变没有引起酶水解活性的改变。KPC22酶是由863个核苷酸编码的157个氨基酸残基的肽链,能引起碳青霉烯类耐药,不依赖于膜孔蛋白的丢失。外膜蛋白检测到OmpK36、OmpK35。KPC22酶位于结合质粒的转座子上,具有高传播可能,与KPC21酶不同的是,携KPC22的质粒可水平传播给其他细菌。KPC22酶从肠炎沙门菌和肺炎克雷伯菌而来,DNA序列表明,编码KPC22的质粒与沙门菌中的质粒有98%的同源性,因此,此质粒可在肠杆菌中结合而传播KPC22。以色列在4株大肠埃希菌中检测到了KPC22基因[11],并成功接合到易感菌株上,接合子对亚胺培南的M I C有显著增加,并未达到耐药水平,猜想供体菌很可能还有其他耐药机制,但KPC酶仍是主要耐药的原因。KPC21酶与KPC22酶另一个区别是, KPC21酶对亚胺培南和美罗培南表达耐药,而携KPC22酶的菌株常常对亚胺培南、美罗培南敏感或中介。S m ith Moland等[12]在一株肺炎克雷伯菌中发现KPC酶的同时,表型试验检测到菌株超广谱β2内酰胺酶(ES BL s)阳性,产ES BL s为临床检测KPC22酶带来一定困难。

基因结构分析显示,KPC21酶和KPC22酶可能来源相同,但KPC21的编码质粒可以转移而KPC22的编码质粒不能转移。由此推断KPC不同型的来源可能是相同的转移片段插入到了不同的质粒而引起。KPC22酶能单独引起碳青霉烯类耐药,不依赖于膜孔蛋白的丢失,基因由可转移的70kb质粒编码,位于质粒的转座子上,具有高传播可能。

3.KPC23酶　2000年4月至2001年4月,纽约TI SCH医院的重症监护病房有24例患者被感染了碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌,这是首次报道的亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌引起的感染[13]。凝胶脉冲场电泳(PFGE)证实了此次医院感染由3个不同的克隆株引起,分别为CL5761、CL5762、CL5763。聚合酶链反应(PCR)扩增发现了一种新的KPC酶———KPC23酶。药敏结果显示,对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、哌拉西林2三唑巴坦、庆大霉素敏感性降低,但对四环素敏感。KPC23由75kb的质粒编码,可以结合转移。PCR检测显示,3种携带KPC酶的细菌都含有o mpK35、ompK36、ompK37的编码基因,膜蛋白电泳发现缺乏OmpK35,但有OmpK36,由此可能减少了细菌细胞壁的通透性,增强其耐药能力[13] KPC23基因由75kb的质粒携带,质粒可以传播给其他菌株。KPC23酶是由882bp的碱基编码的293个氨基酸残基的肽链,和KPC21酶相比有2个碱基的改变,即Ser174gly和H is272Tyr。可通过电穿孔转移和结合。结合实验发现,所有的KPC结合子对碳青霉烯类的药敏比原菌株要敏感。KPC21、KPC23酶均需要结合膜孔蛋白o mpK35,其表达缺失引起对碳青霉烯类的耐药。

三、KPC酶的实验室检测

Anders on等[14]研究表明,在检测KPC酶介导的耐药性时,厄他培南比单独的美罗培南、亚安培南敏感性更强。除了微量肉汤稀释法(BMD),美罗培南、亚胺培南的敏感性均比厄他培南低很多。但每种实验方法厄他培南的特异性都不及前两者。厄他培南是检测KPC基因的最佳底物,临床上可以将其列为常规药敏试验。对所具有ES BL s/AmpC酶样表型(即对第3、第4代头孢菌素耐药)的肠杆菌科细菌采用纸片法或E2test法进行厄他培南(或其他碳青霉烯酶)的测定。2008年美国临床实验室标准化研究所(CL I S)关于产碳青霉烯酶的判断标准为:厄他培南M I C≤2μg/mL,美罗培南、亚安培南M I C≤2μg/mL,如M I C为2μg/mL,4μg/mL视作产KPC酶或其他碳青霉烯酶的可能。可以用改良的Hodge试验来评价检测KPC酶介导的耐药性方法,证实是否是