淀粉酶活性测定
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淀粉酶活性与产生的还原糖量成正比
棕红色产物
λmax=540nm
三、操作步骤：
1.酶液制备：
《植物生理生化实验》
1) 淀粉酶原液提取：
石英砂
称取1g 萌发种子 → 置于研钵中
研磨匀浆
2ml蒸馏水
→用少量多次蒸馏水洗入100ml容量瓶，并用蒸馏水定容至 刻度→混匀室温放置10min（常摇动使其充分提取) →混匀 用干燥滤纸过滤至三角瓶中，滤液即为淀粉酶原液。
样品重(g) ×测定时酶液用量(ml) ×5min
《植物生理生化实验》
用水Ⅱ1和水Ⅱ2 、盐Ⅱ1和盐Ⅱ2吸光度值之差，在标准曲 线上查出相应的麦芽糖含量（mg）或除以0.2273，按下式计 算（α+β）-淀粉酶总活力：
(α+β)淀粉酶总活力（麦芽糖mg/g鲜重∙ min）
查得的麦芽糖含量(mg) × 淀粉酶原液总体积(ml)×稀释倍数 =
2) 淀粉酶稀释液： 吸取上述淀粉酶原液1ml，加4ml蒸馏水，摇匀。
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
《植物生理生化实验》
实验四 萌发种子淀粉酶活性的测定
为什么要测定淀粉 酶活性？？
测定意义：
wk.baidu.com
《植物生理生化实验》
淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾 谷类种子淀粉酶活性最强。
淀粉酶活性高低可以衡量种子萌发速率。
淀粉酶活性高低作为水稻抗逆性的生化指标（如
干旱、盐、重金属胁迫） ……
一、目的要求：
2. 淀粉酶活性测定原理是什么？
3. 测定淀粉酶活性时，为什么要用pH5.6的柠檬酸缓冲液 来配制1%淀粉溶液？为什么1%淀粉溶液要在40℃进 行保温？
《植物生理生化实验》
下周实验内容： P180、P124
实验28 植物过氧化物酶同工酶测定
(所用的电泳槽___圆盘式改成平板垂直)
实验9 植物体内硝酸还原酶活力的测定 (活体法)
《植物生理生化实验》
4. 1%淀粉溶液和淀粉酶提取液反应前，必须 分别置于40℃水浴中预热，保证底物和酶的反应在 最佳温度下进行。
5. 显色需要加热10分钟，时间要严格控制， 而且沸水浴的水位要高于试管中试剂的高度，因显 色程度与水温和加热时间有关系。
六、思考题：
《植物生理生化实验》
1.本实验在测定α淀粉酶活性及(α+ β)淀粉酶活性的 过程中，1号管和2号管有什么不同？为什么每一组都要 设置对照管？
《植物生理生化实验》
用水Ⅰ-1和水Ⅰ-2、盐Ⅰ-1和盐Ⅰ-2吸光度值之差， 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）或除以 0.2273 ，再按下式计算α淀粉酶的活力：
α淀粉酶活力（麦芽糖mg/g鲜重∙ min）
查得的麦芽糖含量(mg) × 淀粉酶原液总体积(ml) =
样品重(g) ×测定时酶液用量(ml) ×5min
五、注意事项：
《植物生理生化实验》
1.样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同 材料酶活性的大小而定。
2.所测样品应在冰浴中充分匀浆(所用研钵和蒸馏水必 须预冷)，在室温下浸提时要常振荡。
3.为了保证酶促反应时间的准确性，在进行钝化和保温 步骤时，水浴温度和时间要严格控制。做到准确记录时间， 尽量减小因各管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴 温度变化不应超过±0.5℃。
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
《植物生理生化实验》
3.显色比色
从上述40℃水浴中取出试管摇匀，置沸水浴中加 热10分钟，取出后冷却，用蒸馏水定容至20ml，摇 匀，在540nm波长下比色，记录测定结果，填写实 验报告原始数据记录表:
四、结果计算：
《植物生理生化实验》
1、了解α－淀粉酶、β－淀粉酶的不同点及其 淀粉酶活性测定的意义；
2、掌握恒温水浴的控温方法； 3、学会用比色法测定淀粉酶活性的原理及其操
作要点；
4、比较不同溶液浸种处理的水稻萌发种子淀粉 酶活性的差异。
二、原理：
《植物生理生化实验》
根据α－和β－淀粉酶的理化性质
α－淀粉酶不耐酸，在pH3. 6以下迅速钝化； β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。
α淀粉酶提取液
1、淀粉酶提取
70℃ 15分钟钝化β淀粉酶
β 淀粉酶提取液
pH3.6 以下0℃ 钝化α淀粉酶
《植物生理生化实验》
淀粉酶 2、(C6H10O5)n + 0.5n H2O 40℃ 0.5n C12H22O11
3、C12H22O11 + 3，5－二硝基水杨酸 3氨基5硝基水杨酸
棕红色产物
λmax=540nm
三、操作步骤：
1.酶液制备：
《植物生理生化实验》
1) 淀粉酶原液提取：
石英砂
称取1g 萌发种子 → 置于研钵中
研磨匀浆
2ml蒸馏水
→用少量多次蒸馏水洗入100ml容量瓶，并用蒸馏水定容至 刻度→混匀室温放置10min（常摇动使其充分提取) →混匀 用干燥滤纸过滤至三角瓶中，滤液即为淀粉酶原液。
样品重(g) ×测定时酶液用量(ml) ×5min
《植物生理生化实验》
用水Ⅱ1和水Ⅱ2 、盐Ⅱ1和盐Ⅱ2吸光度值之差，在标准曲 线上查出相应的麦芽糖含量（mg）或除以0.2273，按下式计 算（α+β）-淀粉酶总活力：
(α+β)淀粉酶总活力（麦芽糖mg/g鲜重∙ min）
查得的麦芽糖含量(mg) × 淀粉酶原液总体积(ml)×稀释倍数 =
2) 淀粉酶稀释液： 吸取上述淀粉酶原液1ml，加4ml蒸馏水，摇匀。
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
《植物生理生化实验》
实验四 萌发种子淀粉酶活性的测定
为什么要测定淀粉 酶活性？？
测定意义：
wk.baidu.com
《植物生理生化实验》
淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾 谷类种子淀粉酶活性最强。
淀粉酶活性高低可以衡量种子萌发速率。
淀粉酶活性高低作为水稻抗逆性的生化指标（如
干旱、盐、重金属胁迫） ……
一、目的要求：
2. 淀粉酶活性测定原理是什么？
3. 测定淀粉酶活性时，为什么要用pH5.6的柠檬酸缓冲液 来配制1%淀粉溶液？为什么1%淀粉溶液要在40℃进 行保温？
《植物生理生化实验》
下周实验内容： P180、P124
实验28 植物过氧化物酶同工酶测定
(所用的电泳槽___圆盘式改成平板垂直)
实验9 植物体内硝酸还原酶活力的测定 (活体法)
《植物生理生化实验》
4. 1%淀粉溶液和淀粉酶提取液反应前，必须 分别置于40℃水浴中预热，保证底物和酶的反应在 最佳温度下进行。
5. 显色需要加热10分钟，时间要严格控制， 而且沸水浴的水位要高于试管中试剂的高度，因显 色程度与水温和加热时间有关系。
六、思考题：
《植物生理生化实验》
1.本实验在测定α淀粉酶活性及(α+ β)淀粉酶活性的 过程中，1号管和2号管有什么不同？为什么每一组都要 设置对照管？
《植物生理生化实验》
用水Ⅰ-1和水Ⅰ-2、盐Ⅰ-1和盐Ⅰ-2吸光度值之差， 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）或除以 0.2273 ，再按下式计算α淀粉酶的活力：
α淀粉酶活力（麦芽糖mg/g鲜重∙ min）
查得的麦芽糖含量(mg) × 淀粉酶原液总体积(ml) =
样品重(g) ×测定时酶液用量(ml) ×5min
五、注意事项：
《植物生理生化实验》
1.样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同 材料酶活性的大小而定。
2.所测样品应在冰浴中充分匀浆(所用研钵和蒸馏水必 须预冷)，在室温下浸提时要常振荡。
3.为了保证酶促反应时间的准确性，在进行钝化和保温 步骤时，水浴温度和时间要严格控制。做到准确记录时间， 尽量减小因各管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴 温度变化不应超过±0.5℃。
2．酶活力测定
《植物生理生化实验》
取9支干净的具塞刻度试管，编号，按下表进行操作：
《植物生理生化实验》
3.显色比色
从上述40℃水浴中取出试管摇匀，置沸水浴中加 热10分钟，取出后冷却，用蒸馏水定容至20ml，摇 匀，在540nm波长下比色，记录测定结果，填写实 验报告原始数据记录表:
四、结果计算：
《植物生理生化实验》
1、了解α－淀粉酶、β－淀粉酶的不同点及其 淀粉酶活性测定的意义；
2、掌握恒温水浴的控温方法； 3、学会用比色法测定淀粉酶活性的原理及其操
作要点；
4、比较不同溶液浸种处理的水稻萌发种子淀粉 酶活性的差异。
二、原理：
《植物生理生化实验》
根据α－和β－淀粉酶的理化性质
α－淀粉酶不耐酸，在pH3. 6以下迅速钝化； β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。
α淀粉酶提取液
1、淀粉酶提取
70℃ 15分钟钝化β淀粉酶
β 淀粉酶提取液
pH3.6 以下0℃ 钝化α淀粉酶
《植物生理生化实验》
淀粉酶 2、(C6H10O5)n + 0.5n H2O 40℃ 0.5n C12H22O11
3、C12H22O11 + 3，5－二硝基水杨酸 3氨基5硝基水杨酸