复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析

复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析

摘要:研究了复合酶法提取金针菇(Flammulina velutipes)多糖的最佳工艺条件,并对金针菇多糖进行了光谱分析｡采用木瓜蛋白酶､纤维素酶复合处理,对加酶质量比､酶解温度､pH､酶解时间4个因素对多糖提取率的影响进行了正交试验｡确定了复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为酶解温度60 ℃,复合酶添加量0.5%,加酶质量比(木瓜蛋白酶∶纤维素酶)2∶1,pH 6.0,酶解时间2 h,此条件下多糖提取率可达9.1%｡

关键词:金针菇(Flammulina velutipes)多糖;复合酶法提取;正交试验;光谱分析Combined-Enzyme Extraction and Spectral Analysis of Flammulina velutipes Polysaccharides

Abstract: The polysaccharides were extracted from Flammulina velutipes by combined-enzyme method and detected by spectral analysis. The factors including dose of cellulase and papain, pH, digestion temperature and time were analyzed by orthogonal test. The results showed that the optimum enzymatic Flammulina velutipes polysaccharides extraction conditions were enzymatic reaction temperature, 60 ℃; Mass ratio of compound enzyme, 0.5%; Application ratio of papain to cellulase, 2∶1; pH, 6.0; Reaction time, 2 h. The extraction yield was up to 9.1% under these conditions.

Key words: Flammulina velutipes polysaccharides; combined-enzyme extraction; orthogonal test; spectral analysis

金针菇(Flammulina velutipes)又名冬菇､朴菇､构菌､青杠菌､毛柄金钱菌,隶属担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)金钱菌属(Flammulina)｡金针菇菌盖滑嫩､菌柄细长脆嫩､形美､味鲜,是世界上著名的食药两用菌和观赏菌[1],具有较高的营养价值和药用价值,有广阔的开发前景｡

金针菇子实体中除含有蛋白质､氨基酸､矿物质､维生素和对人体有益的微量元素外还含有一种重要的生物活性高分子多糖,金针菇多糖由于具有抑制肿瘤､抗癌､增强肌体免疫力[2-4]等作用而受到广泛重视｡如何提高金针菇多糖的提取率､降低成本已成为拓展金针菇使用范围､提高其应用价值的关键｡

传统的浸提法虽然是提取多糖的经典方法,但时间长､效率低､能耗大;金针菇多糖通常被包裹在植物细胞壁内,并且多糖往往和蛋白质结合在一起,以蛋白质多糖的形式存在｡研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质,从而将多糖释放出来而提高多糖提取率,同时降低了多糖中蛋白质的含量,提高了多糖的纯度[5]｡复合酶法处理可以提高多糖提取率､减少能源消耗､缩短提取时间｡因

此,探索更为高效､经济､可靠的提取方法对金针菇多糖的研究开发具有重要的现实意义｡

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料取市售新鲜金针菇,除去根部,清洗切块,粉碎,干燥,过40､60､80､100目筛,过筛之后把各级金针菇干粉分别装到清洁干燥的烧杯中,置于真空干燥箱中待用｡

1.1.2 试剂苯酚,天津市科密欧化学试剂开发中心;葡萄糖,天津市凯通化学试剂有限公司;Sephadex G-75色谱柱,Pharmacia公司;纤维素酶,国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶,北京世纪时尚科贸有限公司｡所用试剂均为分析纯｡

1.1.3 仪器与设备电热恒温水浴锅:上海跃进医疗器械厂;电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;722型紫外分光光度计:北京赛多利斯仪器系统有限公司;离心机:上海跃进医疗器械厂;九阳料理机:山东九阳小家电有限公司;THZ-82A 型台式恒温振荡器:上海跃进医疗器械厂;Lambda-35紫外可见分光光度计:美国PE公司;Spectum one傅里叶变换红外光谱仪:美国PE公司｡

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制定以葡萄糖浓度为横坐标､吸光度为纵坐标作图｡得葡萄糖标准曲线的回归方程为■=0.007 3x+0.014 6,r=0.996 6,在0~50 μg/mL 范围内呈良好的线性关系｡

1.2.2 多糖清液的提取方法称取80~100目的金针菇干粉5 g,放入250 mL的三角瓶中,加入一定量去离子水,混合均匀后置于50 ℃水浴锅中水浴30 min,调节pH,称取木瓜蛋白酶和纤维素酶按一定比例混合,加入5 mL去离子水溶解,金针菇溶液放在水浴中预热至酶解温度,将酶液加入到金针菇溶液中,在恒温振荡器上提取,反应结束,将三角瓶放到沸水锅中,沸水浴10 min灭酶,灭酶结束冷却至室温,将酶提取液放入到离心管中,5 000 r/min离心,取上清液,即得到复合酶法提取的多糖清液｡

1.2.3 蛋白质的去除方法采用Sevag法去除多糖清液中的蛋白质[6]｡在多糖清液中加入其1/4体积的氯仿-正丁醇(氯仿与正丁醇体积比4∶1),将其置于具塞试管中,充分摇匀30 min后用离心机离心10 min,剔去下面的白色浑浊液,取上清液,这样的操作重复进行3~4次即可除去蛋白质｡

1.2.4 多糖的获得方法金针菇多糖在水中的溶解度较大,所以先用去离子水初步提取,之后取上清液,用20 g/L的活性炭脱色1 h,加入体积分数为95%的乙醇,使溶液中乙醇的体积分数达到75%进行醇沉,醇沉过程中要将其保存在4 ℃冰箱中,保持24 h后5 000 r/min离心15 min,取沉淀,置于真空干燥箱中干燥,即可得到