复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析

复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析摘要:研究了复合酶法提取金针菇(Flammulina velutipes)多糖的最佳工艺条件,并对金针菇多糖进行了光谱分析｡采用木瓜蛋白酶､纤维素酶复合处理,对加酶质量比､酶解温度､pH､酶解时间4个因素对多糖提取率的影响进行了正交试验｡确定了复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为酶解温度60 ℃,复合酶添加量0.5%,加酶质量比(木瓜蛋白酶∶纤维素酶)2∶1,pH 6.0,酶解时间2 h,此条件下多糖提取率可达9.1%｡关键词:金针菇(Flammulina velutipes)多糖;复合酶法提取;正交试验;光谱分析Combined-Enzyme Extraction and Spectral Analysis of Flammulina velutipes PolysaccharidesAbstract: The polysaccharides were extracted from Flammulina velutipes by combined-enzyme method and detected by spectral analysis. The factors including dose of cellulase and papain, pH, digestion temperature and time were analyzed by orthogonal test. The results showed that the optimum enzymatic Flammulina velutipes polysaccharides extraction conditions were enzymatic reaction temperature, 60 ℃; Mass ratio of compound enzyme, 0.5%; Application ratio of papain to cellulase, 2∶1; pH, 6.0; Reaction time, 2 h. The extraction yield was up to 9.1% under these conditions.Key words: Flammulina velutipes polysaccharides; combined-enzyme extraction; orthogonal test; spectral analysis金针菇(Flammulina velutipes)又名冬菇､朴菇､构菌､青杠菌､毛柄金钱菌,隶属担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)金钱菌属(Flammulina)｡金针菇菌盖滑嫩､菌柄细长脆嫩､形美､味鲜,是世界上著名的食药两用菌和观赏菌[1],具有较高的营养价值和药用价值,有广阔的开发前景｡金针菇子实体中除含有蛋白质､氨基酸､矿物质､维生素和对人体有益的微量元素外还含有一种重要的生物活性高分子多糖,金针菇多糖由于具有抑制肿瘤､抗癌､增强肌体免疫力[2-4]等作用而受到广泛重视｡如何提高金针菇多糖的提取率､降低成本已成为拓展金针菇使用范围､提高其应用价值的关键｡传统的浸提法虽然是提取多糖的经典方法,但时间长､效率低､能耗大;金针菇多糖通常被包裹在植物细胞壁内,并且多糖往往和蛋白质结合在一起,以蛋白质多糖的形式存在｡研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质,从而将多糖释放出来而提高多糖提取率,同时降低了多糖中蛋白质的含量,提高了多糖的纯度[5]｡复合酶法处理可以提高多糖提取率､减少能源消耗､缩短提取时间｡因此,探索更为高效､经济､可靠的提取方法对金针菇多糖的研究开发具有重要的现实意义｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料取市售新鲜金针菇,除去根部,清洗切块,粉碎,干燥,过40､60､80､100目筛,过筛之后把各级金针菇干粉分别装到清洁干燥的烧杯中,置于真空干燥箱中待用｡1.1.2 试剂苯酚,天津市科密欧化学试剂开发中心;葡萄糖,天津市凯通化学试剂有限公司;Sephadex G-75色谱柱,Pharmacia公司;纤维素酶,国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶,北京世纪时尚科贸有限公司｡所用试剂均为分析纯｡1.1.3 仪器与设备电热恒温水浴锅:上海跃进医疗器械厂;电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;722型紫外分光光度计:北京赛多利斯仪器系统有限公司;离心机:上海跃进医疗器械厂;九阳料理机:山东九阳小家电有限公司;THZ-82A 型台式恒温振荡器:上海跃进医疗器械厂;Lambda-35紫外可见分光光度计:美国PE公司;Spectum one傅里叶变换红外光谱仪:美国PE公司｡1.2 方法1.2.1 葡萄糖标准曲线的制定以葡萄糖浓度为横坐标､吸光度为纵坐标作图｡得葡萄糖标准曲线的回归方程为■=0.007 3x+0.014 6,r=0.996 6,在0~50 μg/mL 范围内呈良好的线性关系｡1.2.2 多糖清液的提取方法称取80~100目的金针菇干粉5 g,放入250 mL的三角瓶中,加入一定量去离子水,混合均匀后置于50 ℃水浴锅中水浴30 min,调节pH,称取木瓜蛋白酶和纤维素酶按一定比例混合,加入5 mL去离子水溶解,金针菇溶液放在水浴中预热至酶解温度,将酶液加入到金针菇溶液中,在恒温振荡器上提取,反应结束,将三角瓶放到沸水锅中,沸水浴10 min灭酶,灭酶结束冷却至室温,将酶提取液放入到离心管中,5 000 r/min离心,取上清液,即得到复合酶法提取的多糖清液｡1.2.3 蛋白质的去除方法采用Sevag法去除多糖清液中的蛋白质[6]｡在多糖清液中加入其1/4体积的氯仿-正丁醇(氯仿与正丁醇体积比4∶1),将其置于具塞试管中,充分摇匀30 min后用离心机离心10 min,剔去下面的白色浑浊液,取上清液,这样的操作重复进行3~4次即可除去蛋白质｡1.2.4 多糖的获得方法金针菇多糖在水中的溶解度较大,所以先用去离子水初步提取,之后取上清液,用20 g/L的活性炭脱色1 h,加入体积分数为95%的乙醇,使溶液中乙醇的体积分数达到75%进行醇沉,醇沉过程中要将其保存在4 ℃冰箱中,保持24 h后5 000 r/min离心15 min,取沉淀,置于真空干燥箱中干燥,即可得到金针菇多糖[7]｡1.2.5 多糖含量的测定方法采用苯酚-硫酸比色法[8],苯酚-硫酸法是以硫酸､苯酚作为显色剂,它们与金针菇多糖发生显色反应后在490 nm波长处测定其吸光度,再通过已经获得的葡萄糖标准曲线计算求得金针菇中的多糖含量｡1.2.6 单因素试验1)物料粒度对金针菇多糖提取率的影响｡将金针菇粉通过40､60､80､100目筛,分别得到小于40目､40~60目､60~80目､80~100目和100目以上的金针菇粉,取一定量的以上5种样品,选择料水质量比1∶15,50 ℃水浴中提取1 h,计算各样品的多糖提取率,研究物料粒度对金针菇多糖提取率的影响｡2)料水质量比对金针菇多糖提取率的影响｡等量称取80~100目的金针菇粉5份,选择料水质量比1∶10､1∶15､1∶20､1∶25､1∶30,分别于50℃水浴中提出1h,计算各样品的多糖提取率,研究料水质量比对金针菇多糖提取率的影响｡3)复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响｡等量称取80~100目的金针菇粉4份,选择料水质量比1∶20,加入适量复合酶[加酶质量比(木瓜蛋白酶∶纤维素酶)=1∶1),控制复合酶质量分别为金针菇粉质量的0.3%､0.4%､0.5%､0.6%,在50℃水浴中提取1 h,计算各样品的多糖提取率,研究复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响｡1.2.7 正交试验影响金针菇多糖的提取因素很多,通过预试验选择其中的4个因素作为研究的对象:加酶质量比(木瓜蛋白酶∶纤维素酶)､酶解温度､pH､酶解时间｡采用四因素三水平正交试验确定提取金针菇多糖的最佳条件,因素与水平见表1｡1.2.8 多糖的色谱分离纯化方法金针菇多糖粗品水溶解后,取10 mL上Sephadex G-75色谱柱｡用恒流泵控制流速(20 mL/h),自动部分收集器收集,每管收集2.0 mL,用苯酚-硫酸法测定各洗脱液于490 nm处的吸光度,收集其流出液,冷冻干燥得到纯化后的样品｡1.2.9 多糖成分分析方法1)红外吸收光谱分析｡采用美国PE公司的Spectum one傅里叶变换红外光谱仪,在400~4 000 cm-1范围内对提取的金针菇多糖进行红外吸收光谱扫描｡2)紫外吸收光谱分析｡采用美国PE公司的Lambda-35紫外可见光分光光度计,在190~800 nm范围内对提取的金针菇多糖进行紫外吸收光谱扫描｡2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 物料粒度对金针菇多糖提取率的影响从图1可知,小于40目､40~60目､60~80目､80~100目和100目以上的金针菇粉的多糖提取率分别为2.7%､2.9%､3.1%､3.4%和3.3%,由此可知80~100目的金针菇粉多糖提取率最高(图1)｡因此试验选定物料粒度为80~100目｡2.1.2 料水质量比对金针菇多糖提取率的影响从图2可知,料水质量比为1∶10､1∶15､1∶20､1∶25､1∶30的条件下金针菇的多糖提取率分别为 2.3%､3.1%､3.4%､3.5%和3.5%,当料水质量比在1∶15和1∶10之间,随着料水质量比的减小,多糖提取率较快地增长,继续减小料水质量比多糖提取率仍有升高,但升高速率减小｡在提取中加水太少､太多皆不利于以后的分离,而且加重了生产中的负担｡因此试验确定料水质量比为1∶20｡2.1.3 复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响从图3可以看出,随着复合酶添加量的增加,多糖提取率也逐渐增加,复合酶添加量大于0.5%后多糖提取率增加趋于平缓,考虑到酶的成本及效果,复合酶添加量宜为0.5%｡2.2 金针菇多糖提取的正交试验结果分析由表2中4个因素的极差值可知,影响金针菇多糖提取率的4个因素的主次顺序是A>D>C>B｡通过正交试验可知复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为A3B2C2D2,即加酶质量比(木瓜蛋白酶∶纤维素酶)为2∶1,酶解温度为60 ℃,pH 6.0,酶解时间为2 h,此时金针菇的多糖提取率为9.1%｡2.3 金针菇的多糖成分分析结果2.3.1 金针菇多糖结构红外吸收光谱分析结果红外吸收光谱是有机化合物结构表征的重要方法,在实验室得到了普遍的应用｡有机化合物的化学键或官能团都有各自的特征振动频率,因此可以测定化合物的红外吸收光谱,根据吸收带的位置,推断出分子中可能存在的化学键或官能团,再结合其他信息便可确定化合物的结构[9,10]｡由图4可知,3 475和3 416 cm-1处峰值是由多糖中O-H的伸缩振动引起的,羟基在分子间发生缔合,并不是游离的;在2 907 cm-1处是由多糖中C-H的伸缩振动引起的;在1 637~1 618 cm-1处吸收峰是-CHO的C=O的伸缩振动引起的,为肽链上酰胺碳基的吸收峰;在1 564 cm-1处是由多糖中C-H的变角振动引起的;在1 472 cm-1处是由多糖中C-O-C和C-O-H的伸缩振动引起的;在849 cm-1处是由β-吡喃环中C-H的变角振动引起的;在820 cm-1处为α-吡喃环中C1-H的变角振动吸收峰;在805 cm-1处是由吡喃环中C1-H的变角振动引起的｡金针菇多糖具有典型的多糖物质的吸收峰,而且多糖中存在吡喃环和呋喃环,具有α､β构p 采用正交试验确定了金针菇多糖复合酶法提取的最佳工艺条件,即木瓜蛋白酶与纤维素酶质量比为2∶1,复合酶添加量为0.5%,酶解温度为60 ℃,pH为6.0,酶解时间为2 h,此时多糖提取率为9.1%｡参考文献:[1] 姜思昌,孙云汉.金针菇的保健功能[J].食品研究与开发,2003, 24(4):88-90.[2] KIHO T,MORIMOTO H,KOBAYASHI T,et al. Effect of a polysaccharide(TAP) from the fruiting bodies of Tremella auranitia on glucose metabolism in mouse liver[J]. Biochnol Biochem,2000,64(2):417-419.[3] 吴梧桐,高美凤,吴文俊. 多糖的抗肿瘤作用研究进展[J]. 中国天然药物,2003,1(3):182-186.[4] KIHO T,USHI S,UKAI S,et al. Structural features and hypoglycemic activity ofa polysaccharide (CS-F10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J]. Biol Pharm Bull,1999,22(9):966-970.[5] 王雪冰,赵天瑞,樊建. 食用菌多糖提取技术研究概况[J].中国食用菌,2010,29(2):3-6.[6] 叶凯贞,黎碧娜,王奎兰. 多糖的提取､分离与纯化[J].广州食品工业科技,2004(3):144-145.[7] 李世敏,刘冬. 金针菇多糖提取新工艺的优化[J]. 食品与发酵工业,2002,28(10):45-48.[8] 董群,郑丽伊,方积年. 改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J]. 中国药学杂志,1996,31(9):550-552.[9] 郭亚贞,王慥,曲鹏鹏. 香菇多糖的纯化和结构分析[J]. 上海水产大学学报,2000,9(1):35-39.[10] 张正行. 有机光谱分析[M]. 北京:人民卫生出版社,1995.[11] TOMATI U,BELARDINELLI M,GALLI E,et al. NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olive mill waste[J]. Carbohydrate Research,2004,339(6):1129-1134.[12] 叶姜瑜,谈锋. 紫芝多糖的纯化及组分分析[J]. 西南师范大学学报(自然科学版),2002,27(6):945-949.。