复合酶解法提取长春碱的新工艺

关键词：复合酶解法；长春花；长春碱；提取工艺 中图分类法 ：R284.2 文献标识码 ：B 文章编号 ：1004-5627（2009）01-0032－04
长春碱是从夹竹桃科植物长春花中提取的一 种具有显著抗癌活性的二聚吲哚类生物碱， 同时 它也是合成其它长春碱类抗肿瘤药物的主要原 料。 长春碱主要是从长春花中提取，目前国内外多 采用溶剂提取和超临界萃取 2 种方法。 其中后者 对设备有较高要求，生产成本太高。 因此，提高溶 剂提取法的提取率是更加可行的方法。 我们将长 春碱的常规提取方法与复合酶解提取法相结合， 可显著提高长春碱的提取率。 在工艺条件优选中， 将单因素法与正交实验法相结合， 以长春碱含量 和提取物得率为指标， 用较少的实验次数对影响 提取的因素进行筛选，优选出最佳的工艺条件。 1 仪器和试剂
的 8 倍量。 由于该组合没有包括在正交表内，必须 进行验证实验。 测得 3 次实验的平均长春碱含量 为 0.039 %（RSD 为 0.26 %）， 平均提 取物得率 为 0.48 %（RSD 为 1.73 %）。 3讨论
从正交实验结果可以看出， 由于纤维素酶能 水解结构致密的植物细胞壁， 有利于胞内物质的 溶出； 而果胶酶能将长春花中的果胶质等不溶物 水解。 因此，纤维素酶及果胶酶联用对长春花中长 春碱含量及提取物得率均有较大的促进作用，故 实验选择复合酶法进行工艺条件优选。 在工艺条 件优选中，将单因素法与正交实验法相结合，优选 出长春碱提取的新工艺条件。 该工艺的提取率明 显优于长春碱的常规提取方法， 有作为工业生产
min 图 1 长春碱标准品色谱图
2.3 样品溶液的含量测定 长春花全草粉碎，过 40 目筛，准确称 取药 材 粉 末 100 g，依 据 正 交 表 的 安排，加入水、纤维素酶、果胶酶，调 节 pH，充分搅 拌，在选定的温度下酶解一定时间，取出于 60℃烘 干。 烘干后的粉末按长春碱常规提取工艺提取 ， ［2，3］ 即用 0.7 %硫 酸 水 液 500 ml 浸 泡 24 h，过 滤 ， 用水 500 ml 浸泡 12 h，过 滤，重复浸泡 3 次，合并 滤 液 ， 用 氨 水 调 pH 为 10， 中 和 液 每 500 ml 分 别 用二氯 甲烷 100、80、80 ml 萃 取 3 次 ，萃 取 液 减 压 回收，甲醇定 溶于 100 ml 量瓶中 ，制成样 品 溶 液 。 用微量 进样器吸 取 样 品 溶 液 10 μl 进 样 ， 测 定 长 春碱峰面积，用回归方程计算浓度。 样品溶液色谱 图见图 2。
高 效 液 相 色 谱 仪 （ 日 本 岛 津 ，HITACHIL 7000）， 雷磁 pH 计 （上海楚柏实验室设备有限公 司 ，PHS-3C 型 ），电 子 天 平 （AR135 型 ），电 热 恒 温 培养箱（HPX－9052MBE）。 长春花药材由海南好阳 光 农 业 开 发 有 限 公 司 提 供 ； 长 春 碱 对 照 品 由 sigmar 公司 提供 ， 纯 度 99%； 纤 维 素 酶 ， 活 性 单 位 20000 U ／ g， 由福 州福达生物 工程有限公 司提供； 果 胶 酶 ，活 性 单 位 20000 U ／ g，由 福 州 福 达 生 物 工 程有限公司提供。 二氯甲烷、硫酸、氨水、磷酸、二 乙胺为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 参 照罗猛等［1］的 方法。 色谱柱 ： C18 ODS（Hypersil，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动 相：水∶二乙胺为 986∶14，用磷酸调节 pH 为 7.2（溶 液 A）； 甲醇∶乙腈为 4∶1 （溶液 B），380 ml 溶液 A 和 620 ml 溶液 B 混合作为流动相 ； 流速为 1 ml ／ min；进样量 10 μl；柱温 28℃；检测波长 220 nm。 2.2 标准曲线的制备 精密称取长春碱对照品 约 25 mg 于 25 ml 量 瓶中，加甲醇 至 刻 度 ，从 中 精
第1期
王 瑾等：复合酶解法提取长春碱的新工艺
33
提取物得率 ／％
长春碱含量 ／％ mV
min 图 2 样品溶液色谱图
2.4 提取物得率 测定 精密吸 取样品溶液 50 ml 于水浴上挥干，置恒温干 燥箱中 105℃烘 3 h 至恒 重 ，于 干 燥 器 中 冷 却 0.5 h， 称 重 ， 计 算 提 取 物 得 率。 2.5 提取工艺的优选 2.5.1 单因素法 用单因素法考察交互影响相对 较弱、水平较多的因素，如酶解时间、酶解 pH 值的 最佳工艺条件。 2.5.1.1 酶 解 时 间 对 长 春 碱 含 量 和 提 取 物 得 率 的影响 按复合酶解法提取工艺， 以纤维素酶 1.5 % 、 果 胶 酶 1 % 的 量 加 入 复 合 酶 ， 在 温 度 50℃，pH 4.5 条 件 下 酶 解 不 同 时 间 ， 长 春 碱 含 量 和提取物得率见图3、图 4。随着酶解时间的延长， 长春碱含量和提取物得率逐渐提高。 酶解 4 h 后，延长时间对提取影响不大，说明酶解已基本 完全。 因此，适宜的酶解时间定为 4 h。
长春碱含量 ／％
酶解时间 ／h 图 4 酶解时间对提取物得率的影响
酶 解 pH 值 图 5 酶 解 pH 值 对 长 春 碱 含 量 的 影 响
提取物得率 ／％
酶解时间 ／h 图 3 酶解时间对长春碱含量的影响
2.5.1.2 酶 解 pH 值 对 提 取 物 中 长 春 碱 含 量 和 提 取物得率的影响 按复合酶解法提取工艺， 以纤 维素酶 1.5 %、果胶酶 1 %的量加入复合酶 ，在温 度 50℃，不 同 pH 条 件 下 酶 解 4 h，长 春 碱 含 量 和 提 取 物 得 率 见 图 5、图 6。 pH 为 4.5 时 ，复 合 酶 活 性最高，长春碱含量和提取物得率达到最大值。 因 此，适宜的酶解 pH 值为 4.5。
0.50
3
3
2
1
0.036 0.035 0.040 0.111
0.51
k1 0.083 0.089 0.100 0.095
k2 0.112 0.108 0.104 0.105 k3 0.109 0.107 0.100 0.104 R 0.029 0.019 0.004 0.010
k1
0.34
0.37
提取物 得率 ／%
表 2 L9（34）正 交 实 验 结 果
因素
长春碱含量 ／%
提取物得
A
B
C
D
Yi1
Yi2
Yi3
Yi
率／%
1
1
1
1
0.023 0.020 0.020 0.063
0.26
1
2
2
2
0.033 0.034 0.029 0.096
0.39
1
3
3
3
0.028 0.031 0.031 0.090
34
福建中医学院学报
第 19 卷
水平 1 2 3
A 纤维素酶用量 ／% 1.0 1.5 2.0
表 1 L9（34）因 素 和 水 平 表 B 果胶酶用量 ／% 0.5 1.0 1.5
C 酶解温度 ／℃ 45 50 55
D 加水量 ／ 倍 5 8 10
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
长春碱 含量 ／%
mV
密吸取 1、2、3、4、5 ml 分别于 10 ml 量瓶中， 甲醇 定溶， 制成浓度为 0.1～0.5 mg ／ ml 的 长春碱标准 品溶液。 用微量进样器分别吸取上述标准品溶液 10 μl 进样，测定峰面积，以长春碱浓度（C）为横坐 标，以峰面积（Y）为纵坐标进行回归分析 ，得到回 归方程为：Y=28.4＋1.96×107 C r=0.9999。 长春 碱标准品色谱图见图 1。
收稿日期 ：2008-09-18 基 金 项 目 ：福 建 省 卫 生 厅 青 年 基 金 （2006-1-25）、福 州 市 科 技 局 科 技 计 划 孵 化 器 发 展 专 项 （2006-F-140） 作 者 简 介 ：王 瑾 （1979— ），女 ，助 理 研 究 员 ，主 要 从 事 中 药 化 学 成 分 的 研 究 。
0.42
0.42
k2
0.48
0.46
0.45
0.44
k3
0.48
0.46
0.44
0.44
R
0.14
0.09
0.03
0.02
方差来源 A B C D
SSe2
离差平方和 5.0×10-4 2.0×10-4 1.6×10-5 6.6×10-5 1.0×10-4
表 3 长春碱含量方差分析
自由度 2 2 2 2 18
方差 2.5×10-4 1.0×10-4 8.0×10-6 3.3×10-5 5.6×10-6
F 44.64 17.85 1.43 5.89
P ＜0.01 ＜0.01
＜0.05
2.5.3 结果分析 对正交实验的结果进行直观分 析和方差分析， 发现各因素对长春碱含量的影响 程度为 A＞B＞D＞C， 最 佳 工 艺 条 件 为 A3B2C2D2。 各 因 素 对 提 取 物 得 率 的 影 响 程 度 为 A＞B＞C＞ D，最佳工艺条件为 A2B2C2D2。 因素 A、B 各水平间 有极显著性 差异，P＜0.01； 因素 D 各水平间有 显 著性差异 ，P＜0.05； 因素 C 对实 验结果无 显 著 性 影响。 2.5.4 结论 综合考虑各因素水平对 2 个实验指 标的共同影响， 从减小酶用量和提高长春碱含量 及提取物得 率的角 度 出 发 ， 选 择 组 合 A2B2C2D2 作 为长春碱复合酶解法提取的最佳工艺条件， 即酶 解时间 4 h，酶解 pH 4.5，纤维素酶用 量为 1.5 %、 果胶酶用量为 1 %、酶解温度 50℃、加水量为生药
关 键 词 ：女 贞 子 多 糖 ；α-葡 萄 糖 苷 酶 ；抑 制 作 用 ；非 竞 争 性 抑 制 中图分类号 ：R285.5 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004-5627（2009）01-0035-03