碱法提取质粒

lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。
STE back

0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris· Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0)
在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。
溶液 I

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一．目的


了解提取质粒的原理。
学习和掌握质粒提取的方法和技术。 ——三个基本步骤：

细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化



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二．原理


质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并 且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增 或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广 泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验 技术。 质粒的提取是利用质粒 DNA 与染色体 DNA 分子大小不同和性 质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分 子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱 性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析 出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被 折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。 这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒 DNA提取出来。
0.5 mol/L EDTA (pH8.0)

来自百度文库
在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na·2H2O，在磁力搅 拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0 (约 20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。
1 mol/L Tris·Cl (pH8.0)

在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐 酸调节溶液的pH值至8.0 ，定容至1 L，分装后高压灭 菌。
7.
五．操作步骤 2
8.
9.
10.
11.
12.
12,000rpm 离心 10 分钟，沉淀染色体 DNA ，及不溶的变性蛋白， 取上清。 上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提 1-2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm 离心5分钟，可见溶液 分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。 上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10 分钟。 上清液加入1/10体积 3M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后， 室温放置10-15分钟。 在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录
实验六 碱法提取质粒
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目 录

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一．目的 二．原理 附：原理示意图 三．试剂 四．器材 五．注意事项 六．操作步骤 1 六．操作步骤 2 六．操作步骤 3

GFPuv质粒的信息图片 GFPuv vector’s Description Location of features 1 Location of features 2 Location of features 3 Location of features 4 Vector’s Primer Location Propagation in E. coli
四．器材

1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 离心机 4. 电泳仪和电泳槽 5. 玻璃器皿与耗材

量筒、三角瓶、平皿; EP管(1.5ml, 0.5ml); 枪头(1ml, 0.2ml, 10μl); 牛皮纸、纱布、牙签等

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五．操作步骤 1
1. 2. 3.
TE(pH8.0)

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10 mmol/L Tris· Cl (pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0)
50× TAE

242g Tris 碱 57.1 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)
1× TAE

0.04 mol/L Tris-乙酸 0.001 mol/L EDTA (pH 8.0)
4.
5.
6.
挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中， 37℃振荡培养14~16小时。 取1.2 ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。 加入500μl~1ml STE buffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟， 收集菌体。 加入预冷的溶液I 100μl，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰 浴5分钟 (重悬细胞)。 加入200μl溶液Ⅱ(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清， 保持冰浴 (碱变性染色体DNA、蛋白质)。 在5分钟内，加入溶液III 150μl，轻柔颠倒5~10次，冰浴10分钟 （利用pH差异，复性质粒DNA） 返回目录
50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris· Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0)

在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，
保存于4℃。
溶液 II

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0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS
溶液 III

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5mol/L 乙酸钾 冰乙酸 水 5mol/L。
60ml 11.5ml 28.5ml

所配成的溶液重钾的浓度为 3mol/L ，乙酸根的浓度为
3M乙酸钠(pH5.2） back

在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

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LB培养基


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配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：
细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g
NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH( 约0.2ml) 调 节 pH 值 至 7.0, 加 入 去 离 子 水 至 总 体 积 为 1L ， 15
☆原理示意图 返回目录

☆原理示意图
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返回原理
三．试剂

1. 2. 3. 4. 5.
LB培养基 detail STE detail 溶液 I detail 溶液Ⅱ detail 溶液III detail
detail
6. 3M乙酸钠(pH5.2)
7.
TE(pH8.0) detail