碱法提取质粒DNA

碱法提取质粒DNA
一、目的
掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用
掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。

二、原理
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。

首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。

然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。

氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。

再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。

最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。

最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。

用于下一步凝胶电泳鉴定。

三、仪器设备、材料与试剂
仪器设备
恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计
量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）
玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸
250mL三角瓶
材料：
含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。

四、试剂配制：
●2M 葡萄糖：36g葡萄糖，溶于60ml 蒸馏水中，在加蒸馏水至100ml，
然后用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存。

●10％SDS(十二烷基硫酸纳)：1gSDS，溶于60mL蒸馏水中（加热至68℃
助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2）再加蒸馏水至100ml，无需灭菌。

因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。

称后要及时清洁称量区。

●2M NaOH：NaOH 8g，溶于10ml 蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml。

●1M Tris·HCl (pH 8.0)：蒸馏水600ml，Tris121.2g；HCl35ml；用HCl
将pH调至8.0，再加蒸馏水至1000ml。

●2M Tris –HCl (pH7.4)：蒸馏水300ml；Tris121.2g；HCl35ml；用HCl
将pH调至7.4，再加蒸馏水至500ml。

●0.1M EDTA (pH8.0)：18.7g EDTA-Na2-2H2O,溶于300ml蒸馏水中，用10N
NaOH将pH调至8.0，加蒸馏水至500ml，室温保存。

●去离子灭菌水
●70%乙醇：用新开装的无水乙醇35mL，加去离子灭菌水定容至50mL配
成，储存于4℃冰箱，用后即放回。

●氨苄青霉素（Amp）：100mg/mL
●卡那霉素（Kan）：50 mg/mL
●培养基：LB液体培养基(pH 7.0)200ml分装在6个100mL体积的三角瓶内，
灭菌。

29.4g 乙酸钾，加50ml蒸馏水，用冰乙酸将pH 调至4.8，再加蒸馏水至100ml。

●T ris饱和酚（pH7.0）：苯酚需要重蒸后加Tris·HCl (pH7.4)制成饱和酚。

●T ris饱和酚（pH7.0）: 氯仿 : 异戊醇=25 : 24 : 1(Ｖ／Ｖ／Ｖ)
五、实验步骤及注意事项
六、实验结果：
肉眼观察：是否有白色絮状沉淀？量多还是少？下一步实验：琼脂糖凝胶电泳进一步检测、鉴定。

七、结果分析及讨论。