酶的提取与分离纯化
第三章 酶的提取与分离纯化
第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
酶的提取及纯化
1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。
其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。
2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。
然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。
3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。
4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。
5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。
6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。
其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。
7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。
8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。
需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。
同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。
总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。
通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶的提取与分离纯化幻灯片PPT
硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇
羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素
聚乙二醇（PEG） 磷酸钾、硫酸铵
硫酸钠、硫酸镁
②萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。
③应用 胞内酶的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
菌种
相系统
延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐
天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐
-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex
乙醇脱氢酶 Baker’s yeast PEG/ 盐
青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐
双水相萃取法的重要研究方向
--亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分
解或溶解度小的物质分开。 降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶
解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。
●常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为： 液体CO2无毒 临界温度（304.06K）接近常温 临界压力（7.38MPa）较低 操作安全
超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用
CO2萃取部分产品
V=V0—S—12--—SS12—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
★
⑵添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的
盐浓度又Байду номын сангаас高时。
按下式计算，得表中数据
W=
B(S2-S1) —1-—AS—2 ———
A,B——常数，与温度有关。
02【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分-蛋白质的结构解析与序列测定01部分
第一章酶的分离提取与纯化1.1离心分离和层析分离1.1.1酶的提取方法离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。
离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1.1.1.1离心机的种类与用途常速离心机，高速离心机，超速离心机1)常速离心机：转速<8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2)高速离心机：转速：1~2.5*104r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器3)超速离心机：转速：2.5~12*104r/min用途：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化1.1.1.2离心方法差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗粒分不分离的方法。
用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
常用介质：蔗糖、甘油3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。
介质：铯盐1.1.1.3层析分离技术又称色谱技术，是一种物理的分离方法。
利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离根据分离原理分类吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等1)吸附层析原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。
2)分配层析原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
酶的提取与分离纯化
整理课件
19
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
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14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
整理课件
31
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
整理课件
36
第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
主要影响因素
扩散的影响：
酶分子的扩散速度与温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离以及两相 界面的浓度差有密切关系。提高温度、降低溶液黏度、增加扩散面积、缩 短扩散距离, 增大浓度差等都有利于提高酶分子扩散速度, 从而增大提取效 果。 含酶原料的颗粒体积越小,则扩散面积越大,有利于提高扩散速度;适当的搅 拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面,从而增大两相界面的浓 度差,有利于提高扩散速率;适当延长提取时间,可以使更多的酶溶解出来,直 至达到平衡。
2. 酸溶液提取
3. 碱溶液提取 4. 有机溶剂提取
表4-2 酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶
酸溶液提取
碱溶液提取
pH值为2～6的水溶液
pH值为8～12的水溶液
指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
饱和度＝
溶液中饱和硫酸铵的体积
溶液的总体积
3) 调整盐浓度的方式
a.
饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又 不太高时。
配制饱和硫酸铵溶液
在水中加入过量的固体硫酸铵, 加热至50～60℃, 保 温数分钟 , 趁热滤去过量未溶解的硫酸铵 , 滤液在0℃ 或 25℃平衡1～2 天, 有固体析出, 此溶液即为饱和硫酸铵溶 液, 其饱和度为1。
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同, 通过添加 一定量的某种有机溶剂, 使酶或杂质沉淀析出, 从而使酶 与杂质分离 在酶液中加入某些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀下来, 从而使酶与杂质分离
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
酶的提取与分离纯化
破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除
去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）
（精制）：除
去与产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and 纯化工艺评价
desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
酶工程
姜 静 jing_jiang1974@ QQ: 1336754154
生物制药教研室(A511)
1
知识回顾
酶蛋白制备
构 建 表 达
分 离 选 育
发 酵 生 产
分 离 纯 化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞
38
特点：
•区带内的液相介质密度小于样品物质
颗粒的密度。 •适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。
39
密度梯度离心示意图
（a）离心前
（b）离心后
40
Density gradient ultracentrifugation
41
密度梯度离心
步骤： A.形成密度梯度
B. 加样
C.离心
D.收集样品42
46
表观特点
47
（四）离心条件
离心力: RCF = 1.12 10-5 N2 r 离心时间:
t=K/S*(最高立离心速度/所需离心速度)2 K=(lnr2-lnr1)/ω2= =(lnr2-lnr1)×2.35×1011/n2
温度和pH:
48
五、沉淀分离（根据溶解度的不同）
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
第五章 酶的提取与分离纯化
把生物技术在研究、开发及应用于生产工艺过程的工作 分为上游及下游两个部分。
下游（后处理工艺）（down stream process）：
如何高收率、高纯度、高质量的从微生物的发酵液中、 细胞培养液中及动、植物组织的提取液中得到所需的产 品。
第一节 细胞破碎
细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。
微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着 支撑细胞的作用。
细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械 损伤或渗透压破坏的功能。是细胞破碎的主要阻力。
细胞膜(内壁):是一层半透膜。膜较薄，主要由蛋白质和脂 质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。
抽提胞内酶：需将细胞壁破碎 破碎细胞方法：
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素：a.压力差 b.压力降低的速度 c.细胞种类和生长期
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最好使用 对数生长期的细胞。
（3）渗透压差法
方法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的 甘油或20％蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低 的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速 进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。于是，细胞 内容物就释放出来。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复 多次。
冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
细胞干燥法：如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷 冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞 的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞 进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。
适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取
仅适用于细胞壁较脆弱的细胞，或者细胞壁预先用酶 处理，或者在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
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低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
酶的提取和分离纯化
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
动物、植物或微生物细胞
酶提取 发酵液
酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分离， 层析分离，电泳分离，萃取分离， 结晶分离等。
电渗析 离子交换膜电渗析
透析
补充1：四种常用膜分离技术的基本特征
补充2：四种常用膜分离过程的截留特性
3.4.4 层析分离（色谱技术）
❖ 定义
是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的 物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两 个相中。
其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相 则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度 移动，从而达到分离。
选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而 不影响所需的酶
3.4.1 沉淀分离
❖盐析沉淀法
盐浓度（中性盐） 离子强度
Ks分段盐析、β分段盐析
饱和度 温度-室温 pH-欲分离酶的等电点
3.4.1 沉淀分离
❖ 等电点沉淀法
等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。
在加酸或加碱调节pH值的过程中， 要一 边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱 而引起的酶变性失活。
3.2 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高 压
为了提取这些胞内酶，
细 胞
首先需要对细胞进行
破
破碎处理。
碎 机
(1)机械破碎
(2)物理破碎
细胞
破
(3)化学破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
酶提取和分离纯化的大致流程
酶提取和分离纯化的大致流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 细胞破裂。
机械法，例如匀浆、研磨。
酶的提取与分离纯化
常压电泳仪（600V）
高压电泳仪（3000V）
超高压电泳仪（30000V～50000V）
（2）电泳槽：
自由界面电泳槽
管状电泳槽
板状电泳槽
（3）附属设备：
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★
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质的一种电泳方法。
通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。
电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
应避免用高电渗物质作支持介质。
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★
2. 电泳的分类
自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在没 有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物 质在支持介质上分离成若干区带。
支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。
分子量成正比。
因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不
受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度
（蛋白质分子量）有关。
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未知蛋白质在相同条件 下进行电泳，可在标准 曲线上求得分子量。
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2. 操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）
1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS） a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定 浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完 全。 b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。
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电
渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。
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2. 电泳的分类
自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在 没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物 质在支持介质上分离成若干区带。
支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。
★
按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白， 优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
系统的不连续性表现在以下几个方面：
★
1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔 径的分离胶。
2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为 pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲 液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。
★
3. 电泳常用设备
（1）电泳仪 ：提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（600V） 高压电泳仪（3000V） 超高压电泳仪（30000V～50000V） （2）电泳槽： 自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽 （3）附属设备：
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二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide
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★ 未知蛋白质在相同条件 下进行电泳，可在标准 曲线上求得分子量。
★
2. 操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）
1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS） a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定 浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完 全。 b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。
★
2）样品制备： a.PAGE: 样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝） b.SDS-PAGE: 样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙 醇，溴酚蓝），煮沸2-5min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样及电泳： SDS-PAGE: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝 距下端1cm时停止电泳。
是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种 最好的办法 。
1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，
与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天 然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种 类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫 键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合 物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质 分子量成正比。 因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不 受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度 （蛋白质分子量）有关。
2. 分离效应
PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳
★
采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应 连续PAGE 不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应
★
电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不 同，迁移率不同。 分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通 过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表 现出不同的迁移率。 浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条 窄带，然后再进入分离胶进行分离。
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH
★
N,N’-甲叉双丙烯酰胺
Bis
聚丙烯酰胺
★
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP） 加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED） 催化剂: 核黄素（维生素B2） 引发剂: 光 . TEMED的存在，可加速聚合。
gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝
胶作为支持介质的一种电泳方法。
★
1.原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr） 和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催 化剂和加速剂作用下聚合的。
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺 Acr
-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O NH NH2
酶的提取与分离 纯化
一、电泳的基本理论
1. 原理:
★
在一定pH条件下（用buffer），不同大小、 形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同 （用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形 成紧密的泳动带。 +
-
★
影响迁移率的因素：
颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v 越快。
电场强度：E越高，v越快。 电泳液： pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定） 离子强度：离子强度越高，v 越低。 通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。
★
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可 分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bis的重量比应在30左右。
★
聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表
样品 蛋白质 分子量（Da） <104 1～4×104 4×104～1×105 105～5×105 >5×105 适宜的凝胶浓度（％） 20～30 15～20 10～15 5～10 2～ 5
以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子
筛效应，主要靠 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大， 对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ④聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶 的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。
★
三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳
（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS- PAGE）简称SDS－PAGE。