酶的提取与分离纯化

电
渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。
★
2. 电泳的分类
自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在 没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物 质在支持介质上分离成若干区带。
支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。
★
按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白， 优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。
★
★ 未知蛋白质在相同条件 下进行电泳，可在标准 曲线上求得分子量。
★
2. 操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）
1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS） a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定 浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完 全。 b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。
★
3. 电泳常用设备
（1）电泳仪 ：提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（600V） 高压电泳仪（3000V） 超高压电泳仪（30000V～50000V） （2）电泳槽： 自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽 （3）附属设备：
★
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide
以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子
筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。
★
③琼脂糖凝胶电泳： 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大， 对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ④聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种 最好的办法 。
1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，
与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天 然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种 类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫 键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合 物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质 分子量成正比。 因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不 受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度 （蛋白质分子量）有关。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
系统的不连续性表现在以下几个方面：
★
1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔 径的分离胶。
2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为 pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲 液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。
★
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可 分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bis的重量比应在30左右。
★
聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表
样品 蛋白质 分子量（Da） <104 1～4×104 4×104～1×105 105～5×105 >5×105 适宜的凝胶浓度（％） 20～30 15～20 10～15 5～10 2～ 5
不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶 的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。
★
三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳
（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS- PAGE）简称SDS－PAGE。
2. 分离效应
PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳
★
采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应 连续PAGE 不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应
★
电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不 同，迁移率不同。 分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通 过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表 现出不同的迁移率。 浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条 窄带，然后再进入分离胶进行分离。
酶的提取与分离 纯化
一、电泳的基本理论
1. 原理:
★
在一定pH条件下（用buffer），不同大小、 形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同 （用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形 成紧密的泳动带。 +
-
★
影响迁移率的因素：
颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v 越快。
电场强度：E越高，v越快。 电泳液： pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定） 离子强度：离子强度越高，v 越低。 通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。
gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝
胶作为支持介质的一种电泳方法。
★
1.原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr） 和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（BBaidu Nhomakorabeas）在催 化剂和加速剂作用下聚合的。
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺 Acr
-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O NH NH2
★
2）样品制备： a.PAGE: 样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝） b.SDS-PAGE: 样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙 醇，溴酚蓝），煮沸2-5min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样及电泳： SDS-PAGE: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝 距下端1cm时停止电泳。
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH
★
N,N’-甲叉双丙烯酰胺
Bis
聚丙烯酰胺
★
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP） 加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED） 催化剂: 核黄素（维生素B2） 引发剂: 光 . TEMED的存在，可加速聚合。