解磷菌

六 技术路线探讨
苏北盐碱滩涂土壤
解磷微生物的分离筛选
高效解磷菌的鉴定
高效解磷菌最佳培养条件
高效解磷菌剂
分子鉴定
传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为 依据，即通过培养后观察菌落形态和个体 显微特征，将菌种鉴定到纲、门、科、属、 种。然而真菌的形态特征复杂，且少数形 态特征和生理生化指标随着环境的变化而 不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引 起分类系统的不稳定或意见分歧。 在真菌的现代分类学中引入了分子生物 学技术鉴定方法，可以使菌种的鉴定在以 形态特征和生理生化特征为基础的鉴定上 更加准确、可靠。
江苏海岸带地势开阔，土壤类型单 调，海堤以外主要分布滨海盐土类， 堤内老垦区分布潮土类。潮间带的土 壤为滨海盐土(海堤外至零米线的地区)， 分为潮滩盐土、草甸海滨盐土和沼泽 海滨盐土三个亚类。 一般来说，从潮滩盐土到沼泽海 滨盐土， 土壤呈现含盐量逐渐降低， 有机质含量逐渐升高的趋势。
开发利用沿海滩涂土壤是我国农业生产中十 分迫切和重要的任务。随着耐盐作物育成和耐盐 经济植物发现 ，这些植物的营养状况将成为今后 解决的问题。 盐碱土壤的另一特点是可溶性有效磷含量低， 绝大部分以难溶性磷酸盐形式存在。而且盐碱土 壤一般无机盐丰富，有机质严重缺乏，土壤板结， 不宜施无机肥。 我国每年1/3的磷肥需要进口，复合肥料和微 生物肥料使用率不到30%（发达国家达到50%）。 土壤中的解磷微生物，可将土壤中难溶磷酸 盐转化为植物易吸收的可溶性磷，这为改善盐土 植物营养状况提供了出路。
发酵条件优化 发酵条件优化一般分为两步：第一步确 定各个培养因子的最佳种类，第二部确定 各个最佳因子的最佳水平。 第一步一般采用分别确定各因子最佳种 类的方法。例如，在其他培养条件相同的 情况下，选用同一水平的不同碳源（葡萄 糖，蔗糖，淀粉，糖蜜，小麦麸皮等）培 养微生物，根据结果（如菌体鲜重，解磷 能力等）选择出最佳碳源。
rDNA是核基因组中的序列，受到细胞 核中保护机制的保护，同时具有多变区和 保守区，利用其保守区可以研究高级分类 阶元关系，而利用多变区则也可研究种和 种下关系。 如核糖体DNA中18S，5.8S和28S的基 因组序列在大多数生物中趋于保守，在生 物种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2 作为非编码区，承受的选择压力较小，相 对变化较大，并且能够提供详尽的系统学 分析所需要的可遗传性状。 (技术路线)
二 解磷微生物的种类与分布
解磷微生物(Phosphate-solubilizing microoganism，PSM)是一类能够将植物难 以吸收的磷转化为可利用状态的微生物， 这类解磷微生物除了可以活化土壤中难溶 性的磷外，还可以通过影响植物根系分泌 物的种类和数量，以增加植物根系对周围 K,Ca,Mg,Fe,Zn等营养元素的吸收，使植物 能够适应盐碱缺磷的环境。
目前用于未知菌分类鉴定的核酸序列分 析最常选用的目的片段是rDNA。真菌基因 组中编码核糖体的基因包括4种，28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。 它们在染色体上头尾相连、串联排列，相 互之间由间隔区分隔。 间隔区是位于核糖体大小亚基基因之间 的核苷酸序列。位于28S rDNA的3 ’端与 18S rDNA的5 ’端之间的序列称为核糖体内 转录间隔区(internal transcribed spacers， ITS)，ITS1位于18S rDNA和5．8S rDNA之 间，ITS2位于5.8S rDNA和28S rDNA之间 (见图1)
人们在20世纪初开始注意到微生物与 土壤磷之间的关系。Sackett(1908)发现一 些难溶性的复合物施入土壤中，可以被作 为磷源而应用，他们从土壤中筛选出50株 细菌，其中36株在平板上形成了肉眼可见 的溶磷圈。1948年Gerretsen发现植物施入 不溶性的磷肥，经接种土壤微生物后，促 进了植株的生长，增加磷的吸收。他分离 出了这些微生物，发现这些微生物可帮助 磷矿粉的溶解。从此．许多科学家致力于 解磷菌的研究，相继报道了许多微生物具 有解磷作用。
土培(或砂培)法:一般是通过接种解磷菌 株到培养植物的土壤(或砂土)中，以不接种 解磷菌的植株为对照，通过测定土壤浸提 液中有效磷的含量来评定解磷菌株的解磷 能力。砂培法通常也结合同位素示踪法使 用。 同位素示踪法:在含标记有32P的不溶性 磷化合物(有机磷或无机磷)的培养基内接种 供试菌株，使菌体在培养过程中吸收32P， 再用含32P的菌体(以含32P的不接种菌株培 养基为对照)培育植物幼苗，测定该植株由 标记的菌体内吸入的32P量比对照样处理的 增加量，即为该菌体的解磷量。
按分解底物可以将解磷微生物分为两类：一 类是能够分解无机磷化合物的称为无机磷微生物 (包括假单孢菌属的一些种，无色杆菌属的一些种， 黄杆菌属的一些种以及氧化硫硫杆菌); 一类是具有分解有机磷化合物能力的称为有 机磷微生物（包括芽孢杆菌属的一些种，变形菌 属的一种，沙雷氏菌属的一些种）。 但由于解磷微生物解磷机理复杂，相当一部 分的解磷既能分泌有机酸溶解无机磷盐，又能分 泌磷酸酶物质分解有机磷（包括节杆菌属的一些 种、链霉菌属的一些种），因而很难准确区分无 机磷和有机磷微生物。
五 解磷能力的测定
解磷能力是表征解磷微生物作用的重要指标， 可采用定性法和定量法两种方法测定。 定性法一般指的是平板溶磷圈法; 平板溶菌圈法:将溶磷菌株在含有难溶性磷酸 盐或有机磷的固体平板培养基上培养，测定周围 菌落产生透明圈的大小。无机磷平板一般采用磷 酸钙盐固体培养基，接种菌株培养数天后，以磷 酸钙盐平板上菌落周围出现透明圈的视为有解无 机磷能力的菌株。有机磷平板一般采用卵黄平板 培养基，以卵黄平板上菌落周围出现混浊圈的视 为有解有机磷能力(卵磷脂被水解形成脂肪和磷 酸)。
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第二步一般采用正交实验的方法。
正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多 水平的又一种设计方法，它是根据正 交性从全面试验中挑选出部分有代表 性的点进行试验，这些有代表性的点 具备了“均匀分散，齐整可比”的特 点，正交试验设计是是一种高效率、 快速、经济的实验设计方法。
解磷微生物溶解难溶性磷化物的机制可归结为以下几类: (1) 通过生命代谢活动产生有机酸(细菌一般分泌乳酸、氨基 酸、草酸、延胡索酸和柠檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙 二酸和乳酸等)，这些酸一方面直接溶解土壤中难溶性磷 酸盐，另一方面则是通过鳌合作用释放出土壤磷素。 (2)由NH4+同化作用放出质子降低pH值，引起磷酸盐溶解。 (3)通过呼吸作用放出C02，降低环境pH值，从而引起磷酸盐 的溶解。 (4)磷细菌释放H2S，与磷酸铁进行化学反应产生硫酸亚铁和 可溶性磷酸盐。 (5)腐解植物残体而产生胡敏酸和富里酸。这两种酸能与复合 磷酸盐中的钙、铁鳌合，从而释放出磷酸根。它们也能与 铁、铝及磷酸盐形成稳定的可溶性复合物，这些复合物可 以被植物吸收利用。 (6)微生物对钙离子的吸收，使磷酸根离子进入土壤溶液。 (7)生物矿化作用。即通过分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶等物 质，将磷酸脂等有机磷降解。
解磷微生物(PSM)包括细菌、真菌和放线菌。 目前报道的解磷细菌主要有芽胞杆菌属 (Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏 菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤 杆菌属(Agrobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、 黄杆菌属(Flavobacterium )、肠细菌属 (Enterbacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌 属(Azotobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆 菌属(Chromobacterium)、产碱菌属(Alcali— genes)、节细菌属(Arthrobacter)、硫氧化硫功菌 (Thiobacillus thivoxidans)和多硫杆菌属 (Thiobacillus)等。 解磷真菌主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属 (Aspergillus)和根霉属(Rhizopus )。 而解磷放线菌则绝大部分为链霉菌属 (Streptomyces)。
解磷微生物的分布表现出明显的根际效 应，主要表现在：根际土壤中的数量明显 高于非根际土壤。 解磷菌表现出的强根际效应可能与根 圈磷素营养亏缺诱导有关，但由于根圈微 生物的群落结构受根系分泌物及根脱落物 的影响，导致不同植物根圈微生物的组成 差别很大，这种作用也影响解磷菌的群落 组成。
同时，不同的植被类型和不同的生态环 境中，土壤解磷微生物的数量，种类及菌 群结构也不同。 林启美(2000) 等调查农田、林地、草 地和菜地等4种不同土壤生态环境中解磷菌 数量和种群结构时，发现前3种土壤中的有 机磷细菌只有菜地土壤的1／10，但农田土 壤中解磷细菌的总数所占比例并不低。耕 地土壤有机解磷菌主要是芽孢杆菌属，林 地和菜地则主要是假单胞杆菌属；无机磷 细菌种类比较少。
解磷微生物的筛选就是在分离出的具有 解磷能力的所有菌株中筛选出具有最强解 磷能力的菌株。 一般来说要以该解磷微生物将要应用的 实际环境作为筛选实验的条件，即在与应 环境相同的温度，pH值，盐度等条件下培 养解磷微生物，以解磷能力最强（一般以 培养基中有效磷含量最高为标准）的菌株 作为最优选择。
四 解磷机制
解磷微生物研究进展
郑琨
苏北盐碱滩涂土壤概况 解磷微生物的种类与分布 解磷微生物的分离筛选 解磷机制 解磷能力的测定 技术路线探讨
一 苏北盐碱滩涂土壤概况
江苏沿海滩涂资源总面积约65.24×104 平方公里，由潮上带(25.98×104平方公里)、 潮间带(26.57×104平方公里)及辐射沙脊群 的出露沙洲(12.69×104平方公里)组成。江 苏海岸由砂质海岸、基岩海岸、和淤泥质 海岸组成，以粉沙淤泥质海岸为主，占全 省海岸线长度的90.5％
三 解磷微生物的分离筛选
目前，分离解磷微生物的方法一般是根据在 以磷酸三钙为唯一磷源的平板上产生透明圈来确 定。 例如真菌无机磷培养基：蔗糖2g、葡萄糖2 g、 NH4Cl 1.5g、KCl 0.3g、MgSO4 .7H2O 0.4g、 NaCl 0.2g、磷酸钙20g，蒸馏水1000 mL， pH7.0。 如果筛选耐盐解磷菌株，则需要根据实地盐 浓度在培养基中添加NaCl。