《分子生物学实验》教学大纲

《分子生物学实验》教学大纲

课程名称：分子生物学实验

课程编号：

课程类别：专业基础课/必修课

学时/学分：24/

开设学期：第五学期

说明

一、课程性质

专业基础课/必修课

二、教学目标

本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我院现有的实验条件，通过本课程的学习和实践，学生能够：

1.接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段；

2.熟悉基因工程的主要操作方法和步骤；

3.通过有限的实验室实践，加深对分子生物学主要理论的理解；

4.掌握分子生物学常用仪器设备的操作和应用能力，为今后从事教学、科研及技术开发打下坚实的基础。

三、学时分配表

序号

实验项目

实验时数

实验

类型

内容与要求

小计

实验1

基因组DNA的提取

6

验证性

利用CTAB法提取植物基因组DNA、紫外吸收法测定其含量。通过实验掌握植物基因组DNA 提取及纯化的原理和方法。

实验2

PCR基因扩增

6

综合性

利用PCR扩增目的基因。通过实验掌握 PCR 反应的基本原理与技术；掌握琼脂糖凝胶电泳技术。

实验3

感受态细胞的制备及转化

6

综合性

以CaCl2制备DH5α感受态细胞，利用pMD18-T载体与实验2扩增的目的片段连接，转化DH5a 菌株。用α-互补现象和抗性筛选初步筛选转化子。通过本实验，学习CaCl2制备感受态细胞的方法；掌握DNA重组、细菌转化以及蓝白斑筛选的原理和技术。

实验4

质粒DNA的提取及电泳检测

6

综合性

将实验3筛选到的转化单菌落进行培养、从培养的大肠杆菌中提取质粒、酶切、电泳进行转化子的鉴定。

合计

24

四、实验方法与要求建议

本课程采用传统的实验教学方法，4人一组操作，结合小组讨论与集体讨论、实验设计、分子生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，提高学生从事科学研究的综合素质。

要求学生认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具；实验中严格按操作规程进行，仔细观察，及时记录实验现象及结果，认真做好每一天的实验报告；实验结束后仔细分析和总结实验结果；使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）；在操作过程中发现任何意外现象都要及时向任课教师报告；在实验过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面废物缸内），严禁随地投弃！

五、考核方式及要求

1.考核方式：考试（√）

2.成绩评定：

记分制：百分制（√）

成绩构成：实验成绩（100分）=实验预习（10％）+实验态度、卫生、安全（10％）+实验操作（25％）+实验报告（25％）+实验考试（30％）。

重点考察学生对分子生物学实验基本理论和实验技能的理解、掌握及其灵活应用的能力。

本文

实验一基因组DNA的提取

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：验证性

计划学时：6学时

实验分组：4人/组

二、实验目的

1.学会离心机、移液器等分子生物学常用仪器设备使用方法；

2.掌握总DNA 的提取及纯化技术；

3.掌握紫外吸收法测定DNA含量的方法。

三、实验的基本内容和要求

（一）实验的基本内容

1.提取DNA、纯化

2.紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。

（二）要求：通过实验掌握植物基因组DNA提取及纯化的原理和方法；学习用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。

四、实验仪器设备及材料

1.仪器设备：液氮，恒温水浴，离心机，制冰机，紫外分光光度计。

2.材料：新鲜的或冷冻的植物材料。

五、实验操作要点（CTAB法）

1.将克嫩叶（菠菜、灰条等）叶片加入少许提取液研磨（放入液氮预冷的研钵中，在液氮中研碎更好），收集到离心管中，装入的组织少于1/2离心管；

2.向装有材料的离心管加入等体积（或稍多）预热的CTAB提取液，置于65℃水浴30 min；

3.室温下冷却，加等体积的氯仿-异戊醇（24：1）混合液，颠倒混匀，至溶液成乳化状态。

4.室温5000rpm，离心10min，将上清液移至新的离心管；

5.取上清，重复步骤3，重抽提一次或数次；

6.取上清，加5M NaCl 1ml，混匀，再加2/3体积的异丙醇（预冷），颠倒混匀，等待沉淀，甚至可以过夜（-20℃）；

离心10min，弃上清；

8.沉淀中加入等体积的70%乙醇，洗涤沉淀；

离心10min，挥干乙醇。（自然风干或真空抽干DNA样品）；

10.加适量×TE，溶解沉淀（也可再加入RNase），-20℃保存；

11.紫外分光光度计测DNA样品的纯度、浓度

A260/ A280= 意指高纯度的DNA

A260/ A280= 意指高纯度的RNA

而1 OD260相当于50ug/ml的双链DNA，40ug/ml的单链DNA或RNA.

根据公式可计算DNA浓度：C(ug/ml)= A260/

注：① 若所制样品较浑浊，可用24：1的抽提液再抽提一次，离心，异丙醇（预冷）再沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀，离心，挥去乙醇。

② 若分光光度计测DNA样品的纯度不高，也可用以上方法处理。

六、实验教学建议

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

DNA提取过程中，所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

实验二 PCR基因扩增

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：综合性

计划学时：6学时

实验分组：4人/组

二、实验目的

1.掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。

2.学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳。

三、实验的基本内容和要求

（一）实验的基本内容

1.建立PCR 反应体系

2.扩增