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激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞

动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

1. 定量荧光测量

ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及

分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。

2. 定量共聚焦图像分析

借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度

的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。

3. 三维重组分析生物结构

ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。

4. 动态荧光测定

Ca2+、pH 及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。

5. 荧光光漂白恢复（FRAP）——活细胞的动力学参数

荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、

恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。

6. 胞间通讯研究

动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要

的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+、PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。

7. 细胞膜流动性测定

ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。

8. 笼锁-解笼锁测定

许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种

瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。

9. 粘附细胞分选

ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：

①Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。

②激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。

10. 细胞激光显微外科及光陷阱技术

借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。

通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。

显微镜的分类：光学显微镜、电子显微镜、扫描探针显微镜、扫描隧道显微镜。

一，光学显微镜

利用透镜放大物像送到眼睛或成像仪器，分辨率大约为一微米，可以看到细胞大小的物品。一般来说显微镜大都是指光学显微镜，光学显微镜依设计的不同，又可分为正立显微镜、倒立显微镜（又称倒置显微镜）和解剖显微镜（又称实体显微镜或立体显微镜）；

又有偏光显微镜：又称为岩石显微镜、矿物显微镜或金属显微镜，用以观察岩石、矿物及金属表面，是利用光的不同性质（偏光）而做成的；相衬显微镜：观察变形虫、草履虫等透明生物时，所使用的显微镜。它的特殊装置可以将光透过生物体所产生的偏差，改变为明暗不同；又结合光学显微镜并利用雷射光作为光源，以达到特殊观察需求的有共聚焦显微镜（又译作共轭焦显微镜）。

光学显微镜的基本结构(二十世纪90年代):

1. 目镜（又称为接目镜或眼透镜）

2. 物镜转换器

3. 物镜

4. 粗调旋钮

5. 微调旋钮

6. 载物台

7. 光源

8. 光阑和聚光器

9. 推进器（又称为推片器）

二，电子显微镜

不使用光线而利用电子流来照射标本来观察的显微镜。由于电子用肉眼看不出，因此就使电子透过观察材料，而映在涂有萤光剂的板子上，这种方法称为穿透式电子显微镜。另一种方法是以电流在观察材料的表面移动，然后使观察材料所放出的二次电子流映在真空管上，以这种方式观察的称为扫描式电子显微镜。穿透式电子显微镜可放大80万倍，可以看出分子的形象；扫描式电子显微镜可用以观察立体的表面，放大倍率约20万倍。电子显微镜分为透射电子显微镜、能量过滤透过式电子显微镜、扫描电子显微镜、场发射扫描电子显微镜、扫描透射电子显微镜等类型。某些电子显微镜甚至能看到单一原子。原理：物质波理论告诉我们，电子也具有波动性质，所以可以用类似光学显微镜的原理，做成显微镜。不一样的是，这里将凸透镜改成磁铁，由于电子的波长