目的基因的克隆表达
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
获得目的基因的方法有
获得目的基因的方法有
目的基因是指在生物体中具有特定功能或性状的基因。
以下列举了获得目的基因的几种常见方法：
1. 基因克隆：通过DNA重组技术，将目的基因从原始物种或源DNA中扩增并纯化。
常用的方法包括聚合酶链式反应（PCR）和限制酶切片段连接。
2. 基因合成：通过化学合成方式构建目的基因的序列。
这种方法可用于获得较短的基因片段，尤其是在无法从天然源获得所需基因的情况下。
3. 基因筛选：通过将目的基因与细胞或生物体共转化，然后使用特定的筛选方法（如抗生素抗性或荧光标记）来筛选带有目的基因的细胞或生物体。
4. 基因敲除：使用RNA干扰（RNAi）技术或基因编辑技术（如CRISPR-Cas9），将特定的基因部分或整个基因从细胞或生物体中敲除。
5. 基因转导：通过病毒载体将目的基因传递到细胞或生物体中。
这种方法常用于基因治疗和基因表达研究。
6. 基因突变：通过诱发自然突变或使用化学物质、辐射或基因编辑技术等方法，引起目的基因的变异。
这种方法常用于研究基因功能和性状变异。
7. 基因放大：使用PCR或其他扩增技术，将目的基因扩增到更大的数量，以便更容易进行进一步的实验或应用。
需要根据具体的实验目的和条件选择适合的方法，获得所需的目的基因。
基因的克隆与表达PPT课件
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
同源序列法克隆目的基因 -回复
同源序列法克隆目的基因-回复同源序列法克隆目的基因，是一种通过引入同源序列来克隆特定目的基因的方法。
在这篇文章中，我们将逐步回答什么是同源序列法克隆目的基因，为什么使用同源序列法克隆目的基因，以及如何利用这种方法来克隆目的基因。
一、什么是同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆目的基因是一种利用已知的同源序列来寻找和克隆特定目的基因的方法。
同源序列指的是在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性的DNA序列。
这些同源序列在进化过程中保留下来，其存在可以起到指导相同或类似基因的功能和表达的作用。
因此，通过利用已知的同源序列，研究人员可以迅速准确地寻找并克隆目的基因。
二、为什么使用同源序列法克隆目的基因1. 提高克隆效率：同源序列法可以利用已知的同源序列来辅助基因寻找和克隆，大大提高了克隆的效率。
相比于传统的克隆方法，同源序列法可以节省大量的时间和实验成本。
2. 降低错误率：由于同源序列在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性，利用同源序列进行克隆可以降低基因寻找的错误率。
同源序列可以帮助确定目的基因的大致位置，并提供设计引物和克隆步骤的依据，从而减少寻找目的基因过程中可能出现的错误。
3. 拓宽研究领域：同源序列法可以跨物种进行基因克隆，使得研究人员可以从其他物种中寻找和克隆目的基因。
这种方法可以为研究人员提供更多资源，丰富研究内容，拓宽研究领域。
三、如何利用同源序列法克隆目的基因1. 寻找同源序列：首先，研究人员需要确定目的基因所在的物种，然后在已知的同源序列数据库中寻找与目的基因相似或相关的同源序列。
常用的数据库包括GenBank、EMBL和DDBJ等。
2. 序列比对和分析：将寻找到的同源序列与目的基因的参考序列进行序列比对和分析，确定相似性和相关性的程度。
根据比对结果，可以选择最相似或相关的同源序列作为目的基因的起始点。
3. 引物设计：根据已选择的同源序列，在目的基因的起始点和末端设计引物，以便进行PCR扩增。
基因克隆的原理与技术
基因克隆的原理与技术在现代生命科学领域中，基因克隆是一个非常重要和广泛应用的技术。
基因克隆可以为人们研究生物体的基因组、分子生物学、药物研制、治疗等方面提供可靠的技术支持，同时也为人们更深层次地认识生命的本质提供了洞见。
本文将介绍基因克隆的原理和技术。
1. 基因克隆的原理基因克隆的原理是利用DNA重组技术，将目标基因插入到载体DNA中，再利用细胞转化技术将其导入到宿主细胞中，使其得以复制扩增，达到大规模表达目标基因的目的。
首先，需要准备一段目标基因的DNA序列，这由分子生物学技术提供。
然后，需要构建一个DNA载体，如质粒，它是一个小的环状DNA分子，可以复制自己并携带外源基因。
目前常用的载体包括pUC和pET等。
这些载体还可以携带各种标记，如荧光标记或抗生素抗性基因等。
将目标基因插入质粒中，需要利用特定的酶切和连接反应。
通常，酶切是使用一种名为限制性内切酶的酶切割DNA分子特定的位置，以产生产生单一或多个特定长度的DNA断裂点。
连接反应可以将目标基因和含有适当酶切位点的质粒连接在一起，形成重组质粒。
这些重组质粒可以通过传统的分子生物学方法，如PCR和电泳，进行筛选和鉴定。
2. 基因克隆的技术构建重组质粒之后，需要将其导入到细胞中。
有多种方法可以实现细胞转化，包括热冲击法、电转导法和化学法。
这些方法基本上都涉及到增加细胞膜的通透性，使DNA能够进入细胞质。
在宿主细胞中，携带外源基因的重组质粒可以通过自我复制产生的子代细胞中，随着细胞的繁殖，这些子代细胞也将继续复制重组质粒，从而实现目标基因的大规模表达。
同时，也可以通过选择抗生素筛选等方法来筛选能够稳定表达目标基因的细胞株。
基因克隆技术不仅可以实现外源基因的表达，还可以进行多种蛋白质修饰和改变其结构特性，从而产生更加优越的药物。
此外，基因克隆技术还可以进一步应用于基因疗法等领域中，实现个性化治疗和药物研发。
3. 基因克隆的前景和挑战基因克隆技术的应用已经在多个领域得到了成功。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
目的基因的克隆
●目的基因的克隆1.鸟枪法随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中别离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆别离。
鸟枪法克隆目的基因的根本战略:A.染色体DNA的切断a)超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。
b)全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。
c)局部酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。
B.与载体连接a)如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，那么选择多拷贝克隆载体；b)如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，那么选择表达型载体。
C.转化受体细胞D.筛选含有目的基因的目的重组子2.cDNA法A.完备别离程序提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于适宜的筛选手段找到目的重组子。
完备别离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。
B.特异别离程序提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳别离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。
特异别离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。
C.差异别离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，别离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于别离克隆新基因。
例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之前方可转录。
任务是要别离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。
双链cDNA的克隆A.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。
B.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段C.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收3.PCR法使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响所需的双引物。
目的基因的克隆
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因的构建程序基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
5 ‘
5 5‘
‘ 聚合
5
‘ 5 退火
‘ 5 ‘
5 ‘
变性
5 ‘ 5
‘ 聚合
5 ‘ 5 ‘
5
5‘
底物 ‘
5
‘ 5
引物 ‘
5 ‘
5
加热
‘
5
5
‘
底物 ‘
5 ‘ 5
2. PCR克隆目的基因的基本程序
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因 为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接 ，也可以使用专门的T载体克隆
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
3. PCR盒式引物扩增法
5‘ 端不含磷酸基 团
变性 引物退火
Sau3A部分酶切 加装盒式接头片段
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
12
13
14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
21
22
n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
24
克隆的核酸酶
25
26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
31
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
32
文 库 的 抗 体 筛 选
33
(2) T-DNA标签克隆基因
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
目的基因克隆[方案]
![目的基因克隆[方案]](https://img.taocdn.com/s3/m/17a5319082d049649b6648d7c1c708a1284a0a9b.png)
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
单克隆抗体的重组表达
单克隆抗体的重组表达
单克隆抗体的重组表达主要包括以下步骤：
1. 目的基因克隆：将合成的抗体重链和轻链基因克隆至表达载体中，构建成重链表达载体和轻链表达载体。
2. 载体构建：将目的基因克隆至酶切后的载体，构建重组表达载体。
3. 细胞转染：将两个载体一起共转染至细胞中，如HEK293细胞。
4. 抗体表达：在细胞中表达抗体，通常在转染后的几天内收集含有重组抗体的细胞上清。
5. 抗体纯化：使用ProteinG磁珠纯化瞬时转染细胞上清以及小鼠腹水，得到重组表达的抗体。
6. 抗体鉴定：通过酶联免疫吸附法（ELISA）或其他相关方法，对重组表达的抗体进行鉴定和活性检测。
以上步骤是单克隆抗体的重组表达的基本过程，具体的实验操作可能会根据不同的实验需求和条件有所调整。
同时，重组表达单克隆抗体还需要注意实验操作的规范性和安全性，避免交叉污染和实验误差。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
目的基因的克隆表达一．PCR1.原理DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。
根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。
2. 反应体系LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul10* buffer 2.5*6=15 uldNTP 4*6=24 ulP1 1*6=6 ulP2 1*6=6 ul模板1*5=5 ul水15.25*6=92 ul3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照，不加模板，加入等量的水4.反应过程（1）预变性：94℃,1min(2)变性：90℃,30s(3)退火：45-60℃，45 s（4）延伸:72℃,2min(5)2,3,4,5步循环（6）72℃,10min（7）16℃，保温二．琼脂糖凝胶电泳1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。
我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。
已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。
因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。
在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。
2.具体操作1.制胶（1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀（缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移）（2）在微波炉中打化，每20s摇一下（3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记（4）倒入制胶板中冷却2.点样将loading buffer和基因按1:5混匀，加入凝胶孔中（loading buffer的作用：指示作用；沉淀样品，使DNA粘度增大，以防跑散）3.电泳电压81V,电流46mA，时间25min4.拍照5.胶回收（1）将要回收的样本在回收胶中进行电泳（2）利用紫外分析仪进行切胶，注意避免样本经紫外照射时间太长而发生突变(3) 加入buffer DE-A,混匀后于75℃加热，使胶融化（4）加入buffer DE-B,保证形成均一的黄色溶液（5）吸取混合液转移至DNA制备管，12000rpm离心1min,弃上清（6）将制备管置回2ml离心管，加500ul buffer W1, 12000rpm离心30s,弃滤液。
以同样的方法再用700ul buffer W2, 12000rpm离心1min （buffer W1的作用：洗涤；buffer W2的作用：冲洗，确保清除盐分，消除对酶切反应的影响）（7）将制备管置于1.5 ml离心管，在制备膜中央加入25-30ulEluent 或去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA 八．重组质粒的构建（连接）(1)10ul体系T载1ulRvo188(质粒) 4ulSolution 1 5ul(2)16℃保温过夜（3）T载的特点1.含氨苄抗性基因2.含lacZ基因，编码半乳糖苷酶N端146个氨基酸3.容易与目的基因连接九．蓝白斑筛选（转化至JM109）转化原理：菌株经低温预处理后，再转移到42℃环境中，造成细胞膨胀，细胞膜的通透性改变，极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物，最后被细胞吸收的可能性增大。
（1）提前登记使用超净（2）点酒精灯，消毒（手，台面）（3）10ulT载加入JM109菌液中，并设置阴性对照加入10ul水（4）放入冰中30min以降温（5）在42℃水浴锅中热激75s，使重组基因转化至JM109中（6）放入冰中2min（7）加入900ulLB培养基，进行复苏（8）封口后，摇床培养2.5-3h（9）培养基与IPIG诱导剂1:1Amp(50mg/ml) 1:2x-gal(20mg/ml) 1:2混合均匀后，倒平板（10）6000rpm离心5min,弃去900ul上层液，将剩余的菌液凃平板，并进行标记（11）用铝箔纸将培养皿包裹起来，放入培养箱中过夜培养十．挑斑验证蓝白斑筛选结果1.蓝白斑筛选原理：宿主和质粒编码的片段都没有半乳糖苷酶活性，但同时存在时，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与近操纵基因区段之间实现互补，成为a-互补。
由于a-互补产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG作用下，将无色化合物x-gal切成半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝。
当外源基因插入多克隆位点，导致无a-互补能力，使得带有重组质粒的细菌形成白斑；未转化成功的细菌，无amp抗性，不能生长；转化进空载体，有抗性，但有a-互补能力，形成蓝斑。
2.挑斑鉴定（验证转化是否成功）（1）吸取1mlLB培养基加入九个EP管（2）按1:2加入2ul amp,其中设置一组阴性对照加入水（3）用镊子夹起白枪头，从平板中挑白斑放入EP管中，进行标记（4）放入三角瓶中，在摇床中培养1-3h十一．菌液PCR（验证是否出现假阳性）（1）去100ul挑的白斑培养液加入8个EP管中，封口后水浴10min （2）12000rpm离心1min(使细胞破裂，释放作为模板的质粒)（3）按如下体系加样：Taq DNA聚合酶0.5*10=5ulPCR buffer 2.5*10=25 uldNTP 2*10=20 ulP1 1*10=610ulP2 1*10=10 ul水17*10=170 ul（4）1-8管中加入1 ul上清菌液，9管加1 ul已提取的质粒，10管加1 ul水作为阴性对照（5）复苏1-3h（6）电泳（7）接种在30ml LB培养基中按1:2加60 ul amp，按1/100加300 ul 菌液（8）标记后培养注：培养不宜超过16h，原因是质粒降解；细菌死亡，污染基因组十二．重组质粒提取（1）取4个EP管，加入1.5 ul L B培养基中过夜培养的菌液，12000rpm 离心1min,弃上清；若质粒太少，再加入菌液，重复离心（2）加入250ul buffer S1悬浮沉淀的细菌，混匀（3）加入250ul buffer S2，温和并充分混匀使菌体完全裂解，直至形成透亮的菌液（buffer S2含NaOH，用后立即盖上盖子，防止与CO2反应失效）（4）加入350 buffer S3，温和并充分混匀，翻转6-8次，12000rpm 离心10min（中和buffer S2）（5）吸取上清液并转移至制备管，剩余的菌液加水配平，再次离心；再吸取上清液转移至制备管12000rpm离心1min（6）弃收集管中的滤液，加500ul buffer W1, 12000rpm离心1min,弃上清（洗涤作用）（7）加500ul buffer W2, 12000rpm离心1min,弃上清，再次重复上述步骤（冲洗作用）（8）12000rpm离心2min，彻底清除buffer W2；将吸附柱放入新的收集管中晾15 min，使酒精挥发（9）加入60ul无菌水，静置2min，使质粒洗脱下来，12000rpm离心2min（10）测核酸浓度和吸光度值十三．酶切双酶切原理：限制性内切酶是识别双链DNA分子特定碱基序列的核酸水解酶，能够在识别位点将双链切断，形成黏性末端或平末端，便于与具有相同切口的目的基因连接。
（1）按如下体系加样ddH2O 10ul10*buffer 5ul质粒33ul酶1 1ul酶2 1ul（2）37℃水浴2-4h(3)制胶（4）电泳，验证酶切是否成功（5）胶回收（6）测核酸浓度和吸光度值十四．连接(1)按如下体系加样目的基因Rvo188 15.5ulP质粒6ul酶1ulBuffer 2.5ul(2)16℃保温过夜培养十五．转化至DH5a(1)将两管DH5a菌株放入冰中30min（2）打化固体的LB培养基，按1:2加入amp,混匀后倒2个平板（3）取10ul连接产物加入菌液，对照管什么都不加（4）放入42 ℃水浴锅中进行热激75s(5)从水浴锅中取出，迅速放于冰上2min（6）加入800ulLB液体培养基，混匀后在37℃,165-180rpm的摇床中培养1-2h(7)6000rpm离心6min,弃去800ul上清，剩余200ul左右混匀涂平板（8）放置在37℃培养箱中培养（先正放1-2h,再倒置培养）十六.挑斑及菌液PCR鉴定十七.蛋白诱导表达及SDS-PAGEIPTG 诱导表达原理：E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
（1）设置转入目的基因的BL21菌株和空载两组作为对照，在30ul 培养基中按1:2加入60ul amp,2/100加入600ul菌液，放入摇床震荡培养2h（2）保种将600ul菌液和400ul甘油加入保种管（防止菌株在冰融过程中被水晶刺破），标记后放入-70℃冰箱中保存（3）待菌大量繁殖后，按1:1加入IPTG诱导剂；诱导前的作为对照，诱导表达4h,尽量过夜（4）将电泳槽所用的玻璃板用棉球加洗洁精清洗干净后，用双蒸水冲洗，装好电泳槽，将玻璃板夹紧，用力保证玻璃板下面顶到塑料胶板，否则会漏胶，烘干。
（5）蛋白胶的配制分离胶（下层胶）配制：1.按如下体系加样双蒸水 1.1ml丙烯酰胺 2.5mlTris-HCL 1.3mlSDS 0.05ml过硫酸铵0.05mlTEMED 0.002ml2.混匀后，用移液枪转移至槽内，枪内每次留一部分，防止生成气泡3.加到槽的一半后，再加蒸馏水，使胶压平，置于37℃烘箱中烘干浓缩胶（上层胶）的配制：1.按如下体系加样双蒸水 1.4ml丙烯酰胺0.33mlTris-HCL 0.25mlSDS 0.02ml过硫酸铵0.02ml 催化剂TEMED 0.002ml 加速剂2.插梳子3.凝胶30-60min,拔掉梳子（6）处理样品1.诱导前和诱导后的细胞裂解液（全蛋白）取1ml诱导前和诱导后的菌液，12000rpm离心1min，弃上清；浓缩；在沉淀中加60ul蒸馏水，悬浮均匀后加入36ulSDS-loading buffer和4ulb巯基乙醇，沸水浴15min；12000rpm 离心10min，取上清10ul,进行点样2.诱导后菌液的上清和沉淀取诱导后表达的菌液1ml，进行超声3号转子15min(3s,7s),12000rpm离心1min后分别将上清和沉淀装入EP管中，在沉淀中加60ul蒸馏水，悬浮均匀后加入36ulSDS-loading buffer和4ulb巯基乙醇，沸水浴15min；12000rpm离心10min，取上清10ul,进行点样.(6)SDS-PAGE原理：阴离子去污剂SDS和强还原剂b-巯基乙醇使蛋白质变性并且都带负电荷，因此蛋白质的电泳迁移率主要取决于相对分子质量，与电荷和分子形状无关。