测定α淀粉酶活力的方法

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α–淀粉酶活力测定[辅导]

α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。

2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。

二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。

酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。

1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。

这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。

通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。

2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

（3）应时间大约在10-15分钟。

DNS法测定α淀粉酶活力的方法

生物学研究中关于糖测定中常用的方法
菲林试剂滴定——还原糖，常量分析 DNS比色法——还原糖，微量分析蒽酮比色法——总糖，微量分析
配制系列浓度稀释液的方法
线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；
对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀释（1、1/10、1/100、 1/1000……）；
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反应一定量淀粉为糊精的时间）产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。
计算公式：根据标准曲线计算。
3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）；
182g 酒石酸钾钠（同上）；
6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中；
5g 重蒸苯酚（冷却后加入）；
5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；
完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。
酶活力测定步骤（流程）
蒸馏水（mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量（mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂（mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定需要稀释倍数

实验一 α-淀粉酶活力的测定

1. 结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。 2. 要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制；第二步：标准色的配制；第三步：样品的酶解反应；第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL

③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一下午3点。先交到课代表，由课代表汇总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。

α-淀粉酶测定的操作规程

α-淀粉酶测定的操作规程1、用途：测定人血清中或尿液中α-淀粉酶的酶活浓度。

2、原理：α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶偶联，水解特异性底物4,6-亚乙基-4-硝基苯酚-α-庚糖，产生对-硝基苯酚，对-硝基苯酚生成速率与α-淀粉酶的活性成正比，在405nm波长下用速率法检测。

3、适用仪器：奥林巴斯AU480型全自动生化分析仪.4、样本要求：4.1、样本种类：新鲜无溶血血清或尿液。

4.2、样本采集：常规静脉采血约2ml，不抗凝。

置普通管中，或采用含有分离胶的真空采血管。

尿液保存时应将pH值调节至7.0。

4.3、样本干扰：对反映吸光度有干扰的样本，包括溶血和浑浊的样本都可能影响检测结果遇上述情况建议重新采集标本。

4.4、样本保存：血清样本2℃—8℃可稳定7天，-20℃可保存一个月，忌反复冻融。

尿液样本2℃—8℃可稳定10天.5、检测方法：5.1、试剂的准备：试剂开瓶即可使用。

5.2、检测步骤：2、动生化分析仪操作步骤：参数设置→试剂装载→校准→质控→样品加载→测定→结果审核→报告。

5.3、校准：用K因素进行试剂空白校准，也可使用Diazyme公司校准品进行校准操作，当试剂更换批号、出现质控漂移、仪器做完保养后及重要零件更换时，须重新校准。

5.4、结果计算：全自动生化分析仪会自动给出检测结果。

3、6、参考范围：(各医院应根据本地区实际情况建立自己的参考范围。

）7、注意事项：7.1、试剂具有一定的酸碱性，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。

7.2、使用后的器具应按照规定处理，扔入指定的垃圾箱内，不可随处乱扔，防止环境污染和二次使用。

7.3、由于运输过程产生渗液或漏夜的产品，或在运输贮存中没有按照说明书要求进行维护的试剂，不可使用。

7.4、试剂只用于体外诊断。

8、参考文献：中华人民共和国卫生部医政司，全国临床检验操作规程（第三版），东南大学出版社，2006。

王惠萱、李雪梅、王冈，临床检验操作手册，云南科技出版社，2008.陆永绥、李清华、张伟民主编，临床检验自动化仪器分析标准操作规程，浙江大学出版社，2006.。

测定α淀粉酶活性

测定α-淀粉酶活性的两种方法的比较研究发布时间：2009-09-27来源：生物网文章标签：α-淀粉酶酶活性生物论坛2009-2012年中国α-淀粉酶市场调研及投细菌α-淀粉酶产生菌种筛选α-淀粉酶的活性测定及比活计算摘要α－淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标，为此提出了对小麦α－淀粉酶活性的快速测定方法的研究。

α－淀粉酶活性的测定方法有多种，本文仅探讨了常用的3.5－二硝基水杨酸法和凝胶扩散法。

结果表明，两种方法的测定结果差异不显著，而且两者呈显著正相关；从变异系数上看，后者的变异程度较低，其精度较高；从误差来源上看，前者引起误差的因素较后者多；后者较为简便快速，准确度较高，重复性较好，可用于大批量样品的分析。

关键词小麦α－淀粉酶活性 3.5－二硝基水杨酸法凝胶扩散法１材料和方法1.1 材料和试剂①萌芽的小麦取当年小麦种子，按小麦萌发试验培养，２天后用于测验。

②１％淀粉溶液。

③ 0.40ＮＮａＯＨ。

④ＰＨ5.60的柠檬酸缓冲液Ａ．称取柠檬酸20.01ｇ，溶解后稀释至１Ｌ；Ｂ．称取柠檬酸钠29.41ｇ，溶解后稀释至１Ｌ。

取Ａ液13.70ｍｌ与Ｂ液26.30ｍｌ混匀，即为ｐＨ5.60的缓冲液。

⑤3.5－二硝基水杨酸精确称取3.5－二硝基水杨酸１ｇ溶于２０ｍｌ１ＮａＯＨ中，加入５０ｍｌ蒸馏水，再加入３０ｇ酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至１００ｍｌ，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。

⑥麦芽糖标准液称取麦芽糖0.10ｇ溶于少量蒸馏水中，仔细移入100ｍｌ容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

⑦α－淀粉酶提取缓冲液２０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠（2.7216ｇ／Ｌ）１ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钙（0.11099ｇ／Ｌ）ｐＨ5.5。

⑧５％（Ｖ／Ｖ）碘—碘化钾溶液 1.95ｇＫＩ＋0.65ｇＩ２溶解在100ｍｌ蒸馏水中。

⑨α－淀粉酶36.18ｕ／ｍｇＳｉｇｍａ公司逐级稀释10, 2.50，0.625,0.15625, 0.03906,0.009765ｍｇ／ｍＬ系列标准液。

α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法

α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法α-淀粉酶是一种能够分解淀粉为较小的糖分子的酶类。

它是一种广泛存在于生物体中的酶，包括人类、动物和植物。

淀粉是由α-葡聚糖链构成的多糖，而α-淀粉酶能够通过水解反应将淀粉分子切割成糊精（dextrin）和葡萄糖单糖。

麦芽庚糖苷法是一种常用的测定α-淀粉酶活性的方法。

该方法的原理是利用α-淀粉酶将庚糖苷（G7）中的庚糖分子逐个水解成葡萄糖分子，并且测定庚糖苷水解的速率来间接测定α-淀粉酶的活性。

具体的操作步骤如下：首先，准备一定浓度的庚糖苷溶液作为底物。

然后，在一定温度和pH条件下，将α-淀粉酶加入到庚糖苷溶液中，使其开始催化反应。

随着时间的推移，庚糖苷逐渐被水解成葡萄糖，反应体系中葡萄糖的浓度逐渐增加。

最后，通过测定葡萄糖浓度的变化，可以计算出α-淀粉酶的活性。

麦芽庚糖苷法具有以下优点：首先，该方法操作简单，不需要复杂的仪器设备，只需要常见的化学试剂即可。

其次，该方法对α-淀粉酶具有较高的灵敏度和特异性，可以准确地测定α-淀粉酶的活性。

此外，该方法还可以用于测定不同来源的α-淀粉酶的活性差异。

麦芽庚糖苷法在许多领域都有广泛的应用。

首先，在食品工业中，该方法可以用于测定食品中的淀粉含量和淀粉降解的速率，从而评估食品的品质和保存性。

其次，在生物制药工业中，该方法可以用于监测发酵过程中淀粉酶的活性，以确保产品的质量和产量。

此外，该方法还可以用于医学研究中，例如测定血液或尿液中α-淀粉酶的活性，以辅助诊断某些疾病。

α-淀粉酶检测原理麦芽庚糖苷法是一种简单可靠的方法，广泛应用于食品工业、生物制药工业和医学研究等领域。

通过测定庚糖苷的水解速率来间接测定α-淀粉酶的活性，该方法具有操作简单、灵敏度高和特异性强的特点，为相关领域的研究和应用提供了有力的工具。

二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)

每组 1台每组 1台每组 1台
3.2 器材（每组）
15ml大试管10支 5ml移液管10支 1ml移液管5支 10ml移液管10支比色皿1套（4个）双蒸水1瓶（50ml）洗瓶1个玻璃平皿1套 50ml小广口瓶（棕色）2个 50ml 容量瓶 1个 100ml 容量瓶 1个 500ml 试剂瓶2个 100ml 试剂瓶2个 250ml 三角瓶2个 200ml烧杯2个 500ml烧杯1个记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、研钵、纱布
2.实验原理
α-淀粉酶能够将淀粉分子中的α-1，4糖苷键随机切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能购通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。
3.试剂和溶液
3.4 磷酸缓冲液（pH6.0） 4.52g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.8g柠檬酸（C6H8O7·H2O），定容至 100ml。pH计校正后使用。
3.5 盐酸溶液（0.1M/L） 100ml
4. 仪器及器材
4.1 仪器
电子天平
恒温水浴锅分光光度计记时器
2台
3.1 原碘液称取2.2g碘和4.4g碘化钾完全溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中（教师准备）。 3.2 稀碘液吸取原碘液2ml，加20g碘化钾用水溶解并定容至500ml。 3.3 可溶性淀粉溶液称取2.000g（精确到0.001g）可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水90ml，搅拌加热至完全透明冷却后定容至100ml，现配现用。
生物技术专业系统实验（四）

DNS法测定α-淀粉酶活力的方法课件(1)

密封121.3 ℃ 灭菌处理20min）。用时注意酶
污染。
14
标准曲线制作相关试剂加入表
试剂
管号 123456
标准麦芽糖溶液
（mL）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水（mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量（mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂（mL）
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色
法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，
以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的
麦芽糖的量表示酶活力。
7
酶活力测定（DNS比色法）
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。
利用Excel中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。
12
相关试剂（第一种）
标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取 1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 1000mL。
0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7·H2O ）5.78g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g ，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7·H2O ）7.74g，先在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至
1000mL。
1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉
（105℃烘干2hr）溶于100mL 0.2mol/L
pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中（一般需要

实验四 α-淀粉酶的固定化及其酶活测定

酶活力测定
吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于烧杯中，加入磷酸缓冲液
5 mL，摇匀后，置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热8 min；
加入1g固定化酶，立即计时，100r/min条件下准确反应5 min；
立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL
盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL 盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用 10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。
三、仪器和试剂
仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布等。试剂：
海藻酸钠、无水氯化钙、无水磷酸氢二钠、氯化钠、苯甲酸、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、浓盐酸。
四、实验方法
配A液：
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。
作中Ca2+的作用有何区别？
酶的固定化方法
海藻酸钙凝胶包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化酶胶粒。
海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化酶的操作简便，条件温和，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，还适合于多种细胞的固定化。
五、酶活力计算
中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制）。所得结果表示至整数。允许差：平行试验相对误差不得超过5%
六、思考题

实验一α-淀粉酶活力的测定

结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论，并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度酶液处理后的反应时间、温度、pH值等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差，如使用精确的测量工具、多次测量取平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保存。

测定α-淀粉酶活力的方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。

二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。

酶催化的反应称为酶促反应。

生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

For personal use only in study and research; not for commercial use能提高酶活力的物质，称为激活剂。

激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。

使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。

氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。

应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。

如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。

温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。

同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。

但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。

α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。

α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

α-淀粉酶检测操作规程

α-淀粉酶活力检测操作规程1酶活定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。

2原理在一定温度和PH值条件下，α-淀粉酶将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

3仪器和设备3.1 分析天平：感量0.0001g3.2 精密pH计：精确至0.013.3 分光光度计：应符合GB9721有关规定3.4 电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.2℃3.5 计时器：每小时误差不超过5秒4试剂与溶液4.1 原碘液：称取碘（I2）11g、碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

4.2 稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

4.3 20g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2.000g，精确至0.001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后，以30ml水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配置。

4.4 磷酸缓冲液（pH=6.0）称取磷酸氢二钠（Na2PO4·12H2O）45.03g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，使水溶解并定容至1000mL。

配好后用pH计校正。

5 分析步骤5.1待测酶液的制备：称取酶粉1 g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mlL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上请液小心倾入容量瓶，沉渣部分在加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入100mL容量瓶中，用缓冲液定容到刻度（将估计酶活力除以4，即酶活理应在3.7～5.6u/mL范围内），摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

α、β-淀粉酶活性测定

α、β-淀粉酶活性测定
一、样品提取
3-5克样品→加0.1M/L 柠檬酸缓冲液(pH5.6)5ml+少量石英砂研磨至匀浆→加5ml 缓冲液清洗研钵→倒入10ml 具塞刻度试管→室温放置15-20min ，不断振荡→3500rpm 离心10min →上清液(酶提取液)备用
二、酶活性测定
α-淀粉酶活性测定测定管对照管 1.0ml 酶液 70℃水浴15min 1.0ml 柠檬酸缓冲液 4.0ml 0.4M NaOH 40℃水浴15min 2.0ml 1.0%淀粉，混匀 40℃水浴15min
加4.0ml 0.4M NaOH
各吸2ml 放入20ml 试管
加2ml DNS ，混匀
沸水浴5min
冷却，定容
测OD 520
三、标准曲线的制作
取20ml 的刻度试管6支并编号，分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml ，称取0.10g 麦芽糖定容至100ml)0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml ，然后加水使都达到2ml ，再各加入DNS 2.0ml ，置沸水浴中煮沸5min ，冷却后用水稀释至20ml 。

在520nm 处测其消光值。

消光值为纵坐
(α+β)-淀粉酶总量测定
测定管对照管
0.5ml 酶稀释液
1.5ml 柠檬酸缓冲液
4.0ml 0.4M NaOH
40℃水浴15min
2.0ml 1.0%淀粉，混匀
40℃水浴15min
标，麦芽糖为横坐标作标准曲线。

酶活力的测定方法

实验四α-淀粉酶实验活力的测定方法一、实验目的了解并掌握淀粉酶的测定步骤，掌握其方法。

二、实验原理液化型淀粉酶（α-淀粉酶）能催化水解淀粉，生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。

本实验利用呈色反应来测定液化型淀粉酶水解淀粉作用的速度，从而测定淀粉酶活力的大小。

三、器材和试剂1.器材多孔白瓷斑、50ml三角瓶或大试管（25mm*200mm）、恒温水浴箱、烧杯、容量瓶、漏斗、吸管、纱布。

2.试剂（1）原碘液称取I211g、KI22g，加少量水完全溶解后，再定容至500ml，于棕色瓶中保存。

（2）稀碘液吸取原碘液2ml，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，于棕色瓶中保存。

（3）标准“终点色”溶液。

①准确称取氯化钴40.2439g、重铬酸钾0.4878g,加水溶解并定容至500ml。

②0.04%铬黑T溶液。

准确称取铬黑T40mg，加水溶解定容至100ml。

取①液80ml与②液10ml混合，即为标准色。

冰箱保存。

（4）2%可溶性淀粉称取烘干可溶性淀粉2.00g，先一少许蒸馏水混匀，倾入80ml沸水中。

继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100ml。

此溶液需要新鲜配制。

（5）0.02mol/L、pH6.0磷酸氢二钠溶液称取Na2HPO4·12H2O45.23g和C6H8O7·H2O8.07g,用蒸馏水溶解定溶至1000ml，配好后以酸度计或精密试纸校正pH。

（6）α-淀粉酶粉。

四、操作步骤1.待测酶液的制备（1）精密称取酶粉1-2g，放入小烧杯中。

（2）用少量的40℃0.02mol/L(恒温水浴箱中进行) pH6.0的磷酸氢二盐-柠檬酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研3-4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过四层纱布过滤，滤液供测定用。

（如为液体样品，可直接过滤，取一定量滤液入容量瓶中，加入缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，备用。

）2.测定（1）将“标准色”溶液滴于白瓷板的左上角空穴内，作为比较终点色的标准。

实验一 α-淀粉酶活力的测定

[考核形式及方法]
1. 考核形式
现场操作、提问、报告书的评价等。
2. 考核点（1）现场考核看操作的准确性和规范性。
（2）提问的考核点注重分析问题和解决问题的能力。
（3）报告书的考核点主要考察报告书的结构；实验结果的准确性；实验的创意性；参考文献的数量和质量等。
[思考题]
1. 请说出你所选用的α-淀粉酶活力测定性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理； (2) 掌握淀粉酶的性质及作用；
(3) 熟练α-淀粉酶活力测定方法。
[实验原理] α-淀粉酶催化淀粉水解生成小分子可溶性糊精和少量的麦芽糖、葡萄糖，这些产物与碘反应呈现不同的颜色。通过呈色反应，可了解底物的降解速率，并以此可反映酶活力。
验原理。 2. 在α-淀粉酶活力测定过程中影响活力的因素有什么？在
实验过程中你采取什么措施防止其影响？
3. 举例说明在实际工作中α-淀粉酶活力测定的必要性。 4. 在实验指导书上介绍的几种α-淀粉酶活力测定方法中为什么本实验采用Wohlgemuth改良法？它有何种优缺点？
α-淀粉酶制剂的酶学特性及其应用
名称容量瓶
试剂瓶移液管
大肚移液管
规格 50 mL 100 mL 150 mL 250 mL 500 mL 1000 mL 500 mL 0.5 mL 1 mL 2 mL 5 mL 20 mL
数量
1 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2
[试剂配制]
(1) 原碘液称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g。先用少量蒸馏水使碘化钾完全溶解，再溶解结晶碘，最后用蒸馏水定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (2) 稀碘液取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (3) 0.02 mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0) 称取磷酸氢二钠45.23 g和柠檬酸8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0，置试剂瓶冷藏。 (4) 标准终点色溶液 A液：称取分析纯氯化钴12.0732 ｇ和分析纯重铬酸钾0.1463 g，以蒸馏水溶解定容至150 mL，置250mL试剂瓶暗藏。 B液：称取络黑T 8.0000 mg，以蒸馏水溶解定容至100 mL，置250 mL试剂瓶暗藏。

α-和β-淀粉酶活性的测定

α-和β-淀粉酶活性的测定α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1.4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。

β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末段分解2个葡萄糖单位的α-1.4糖苷键生成麦芽糖。

因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。

1.仪器设备分光光度计、恒温水浴等。

2.操作方法1）粗酶液制备取新鲜植物材料10g，洗净、剪碎，按1：2（w/v）比例加20ml0.1mol/L NaAc缓冲液（含6mmol/L CaCl2，pH5.0）及少量石英砂研磨，一层尼龙布过滤。

滤液在20000r/min离心20min，取上清液用10mmol/L NaAc缓冲液透析。

过夜后用20000r/min离心10min，取上清液定容，备用。

2）绘制β-极限糊精标准曲线称取100mgβ-极限糊精，加少量水调成糊状，倾入10ml沸蒸馏水，不断的搅拌、加热，煮至透明。

流水冷却后定容至10ml，即每毫升含10mgβ-极限糊精。

取25～200μlβ-极限糊精（0.25～2.0mg）加水定容至0.5ml，再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于560nm处测定其光密度（OD）值。

以光密度为纵坐标，β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。

3.α-淀粉酶活力测定（植物生理学通讯，1986，4：63）取0.1~0.5ml粗酶液（相当于含0.1～0.2g鲜重），加0.5mlβ-极限糊精，加10mmol/L NaAc缓冲液定容至1.0ml，摇匀后在30℃保温。

隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-KI试剂，0.4ml H2O，摇匀后在560nm处测其光密度。

按OD值查标准曲线。

计算单位为：mgβ-极限糊精降解/g（鲜重）·h。

4.β-淀粉酶活力的测定（麦芽糖浆生产工艺，上海市轻工业局科技情报研究所出版1989,171)。

1)酶反应在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉，1ml0.1mol/L NaAc（pH5.0）缓冲液，3.9ml H2O，在37℃预热5min，加0.1ml酶液，保温30min后煮沸10min。

实验一α淀粉酶活力测定

1. 结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。 2. 要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
缓冲液
④
5 mL
淀粉液
20 mL
混合液
2.0 mL
⑥
酶液
0.5 mL
50mL
10 mL 溶解
煮沸
冷却 100 mL
30 s
⑦
60 s
⑤
1. 5 mL
碘液
90 s 120 s
0.5 mL
60℃ 60℃,5 min
60℃
180 s 210 s
[实验结果计算]
α-淀粉酶活力
1 g酶粉(或l mL酶液)在60℃、pH6.0条件下，以1 h(60 min) 液化可溶性淀粉的克数(或毫克数)为1酶活力单位，即1IU，单位为可溶性淀粉量(g) /mL·min。
[器皿及耗材]
[试剂配制]
(1) 原碘液称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g。先用少量蒸馏水使碘化钾完全溶解，再溶解结晶碘，最后用蒸馏水定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (2) 稀碘液取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (3) 0.02 mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0) 称取磷酸氢二钠45.23 g和柠檬酸8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0，置试剂瓶冷藏。 (4) 标准终点色溶液 A液：称取分析纯氯化钴12.0732 ｇ和分析纯重铬酸钾0.1463 g，以蒸馏水溶解定容至150 mL，置250mL试剂瓶暗藏。 B液：称取络黑T 8.0000 mg，以蒸馏水溶解定容至100 mL，置250 mL试剂瓶暗藏。