第三章 细胞生物学研究方法

第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞培养、
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细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（ 光学显微镜技术（light microscopy） microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（ Microscope） 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
a)under bright-field;
b)phase-contrast;
c)DIC
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荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） （ ）
原理： 原理：
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光 抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这 类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分 辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等 生物大分子的定性定位最有力的工具。
TEM
0.1nm
电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射和 透射形成明暗反差
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电镜与光镜光路图比较
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电子显微镜的基本构造
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透射电镜及其图像
JEM-1011透射电子显微镜
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主要电镜制样技术
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备。 用于电镜观察的样本制备。 通常以锇酸和戊 二醛固定样品，以环氧树脂包埋， 二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀 或螺旋推进的方式推进样品切片， 或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度 20-50nm。 20-50nm。 负染色技术（ 负染色技术（Negative staining）与金属投 staining） 影 用重金属盐染色背景， 用重金属盐染色背景，衬托出样品的精细结 构
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FRET 原理图
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与融合蛋白表达检测FRET 与融合蛋白表达检测FRET
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荧光漂白恢复技术
又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细 胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种 胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种 结构上分子动态变化率的大小。 结构上分子动态变化率的大小。 原理：利用高能量激光束的照射使特定的 原理：利用高能量激光束的照射使特定的 区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区 荧光的忧复可通过非漂白区的荧光标记分 子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。
优点： 优点：
排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率 可重构样品的三维结构。 (1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。
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共 聚 焦 显 微 镜 及 其 显 微 图 像
激光共聚焦扫描显微镜
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激光共聚焦原理
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荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移（FRET）技 术
是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变 化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白 质分子是否存在直接的相互作用。 FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子 FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子 的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以 的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以 内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称 FRET现象。 FRET现象。 采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于 5～10nm。 10nm。 FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及 FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及 作用的强弱。
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超 薄 切 片 技 术
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负染色技术
Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
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普通复式光学显微镜技术
显微镜物象是否清楚不仅决定于 放大倍数， 放大倍数，还与显微镜的分辨力 有关。 （resolution）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离
n=介质折射率；α=镜口角（聚焦点对物镜镜口的张角）， N.A.=镜口率（numeric aperture）。
microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像， microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像， 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜， 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚 焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细， 焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细， 所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力， 所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内， 的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度 不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像， 不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都 储于计算机内，通过计算机重新组合， 储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结 给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。 构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态， 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于 细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。 细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。
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荧光脱色恢复技术（ 荧光脱色恢复技术（FRAP） ）
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二、 电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
超薄切片技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 电镜三维重构技术
扫描电镜 （Scanning electron microscope，SEM） microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope)
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电镜种类
透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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电镜与光镜的比较
显微镜 LM 分辨本领 200nm 100nm 光源 可见光 （400-700） ） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） ） 透镜 玻璃透镜 玻璃透镜 真空 不要求真空 不要求真空 成像原理 利用样品对光的吸收形成 明暗反差和颜色变化
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冰 冻 蚀 刻 技 术
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电镜三维重构技术
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扫描电镜 microscope，SEM） （scanning electron microscope，SEM）
原理与应用： 原理与应用： 扫描电子显微镜于20世纪60年代问世， 20世纪60年代问世 扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表 面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品， 面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品 表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关， 表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关， 也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集， 也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集， 并在那里被闪烁器转变为光信号， 并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器 转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度， 转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子 束同步的扫描图像。图像为立体形象， 束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后， 构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后， 要喷涂上一层重金属微粒， 要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次 级电子信号。 级电子信号。CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题。 力问题。
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冰冻蚀刻技术（ 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） etching）
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的 冰冻断裂与蚀刻复型 ： 蛋白质颗粒和膜表面结构。 蛋白质颗粒和膜表面结构。
电镜三维重构技术
电子显微术、 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结 合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核 磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学 Biology） （Structural Biology） —— 主要研究生物大分子空间结构及其相互关 ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关 系的主要实验手段。 系的主要实验手段。
应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术
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荧光显微镜及其照片
荧光显微镜照片 （微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
尼康E800荧光DIC显微镜
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激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（ 原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning
录像增差显微镜技术（video录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） microscopy）
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动
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暗视野成像原理
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A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.