发酵液的预处理和菌体的回收
发酵液的处理
影响絮凝效果的因素：
1) 絮凝剂浓度
2) 絮凝剂分子量
3) 絮凝剂类型
4) 溶液的pH
5) 搅拌速度和时间
6) 助凝剂
A. 絮凝剂浓度
浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸 附饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。
B. 高分子絮凝剂分子量
分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量 不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂
发酵液的预处理和固液分离方法
山东农业大学 孙中涛
预处理和固液分离的目的：
1、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸 和蛋白质的沉淀物)。
2、除去部分可溶性杂质。
3、改变滤液的性质（降低粘度等），以利于后继操作。
总策略： 1、胞外产物：应尽可能转移到液相中，常 用调pH至酸性或碱性的方法来达到。 2、胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物 质释放到液相，再分离细胞碎片。 3、通常，以含生化物质的液相为出发点，进 行后继操作。
使蛋白质变性的其它办法：
大幅度改变pH，加酒精、丙酮等有机溶剂 或表面活性剂等。
在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性 范围(pH2—3)或较碱性范围(pH 8—9）使蛋白质 凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。
加有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数 量较少的场合。
利用吸附作用除去蛋白质：
举例：
3、采用酶制剂分解黏性物质
如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化
为单糖，以提高过滤速度。 例如：万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过 滤速度加快。
4、染菌发酵液的处理方法
混凝：
阳离子型高分子絮凝剂对带负电菌体或蛋白质来说，同时 具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以 单独使用， 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，主要通过分子间引力 和氢键产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。 首先加入无机电解质，使悬浮粒子脱稳而凝聚，然后，再 加入絮凝剂。凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从 而，提高了絮凝效果。 这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
发酵液预处理与固液分离
发酵液的预处理和固液分离方法综述摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。
其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
关键字：预处理固液分离正文：一、发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。
从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。
其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。
并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。
所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。
预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。
大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。
如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。
细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。
如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。
图1－1为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。
图1－1 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。
发酵液预处理与浓缩
第四节 萃取分离
基本概念
萃取 extraction 是利用液体或超临界流体为 溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。
4.1 溶剂萃取
供提取的溶液称为料液；从料液中待提取的 物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶剂称 为萃取剂；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形 成的溶液称为萃取液；被萃取出溶质后的料 液称萃余液。
操作方式：间歇式、连续式 型式：管式、套筒
高 速 冷 冻 离 心 机
旋转过滤机
滚 筒 式 离 心 机
4000
三、细胞破碎
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力 破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内含物包括目的 产物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型药物成分的基础。
水层
浓缩，过滤
结晶 (苷C)
溶于乙醇，加Ca(OH)2 减压浓缩，结晶
结晶 (苷C)
甲醇重结晶
西地兰纯品
第三节 膜分离
Membrane separation是利用特殊制造的、具有 选择透过性能的膜，在外力推动下对混合物 进行分离、提纯、浓缩的一种分离方法。
3.1 膜分离概述
膜的定义：
在一种流体相间有一薄层凝聚相物质，把流体相分 隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜 膜还必须具有高度的渗透选择性
1. 酶消化法
细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞 壁反应并破坏它们。酶选择性的与细胞 壁反应，不破坏细胞内的其它物质。反 应条件温和。
此法的缺点在于酶的消耗限制了在 大规模生产中的使用。
2. 机 械 法
• 匀浆法 • 研磨法 • 超声波法：利用频率高、波长短的超 声波进行细胞破碎，效率更高 • 高压均质法
发酵液预处理
1.发酵液预处理过程:对发酵液加热到所需温度使杂蛋白质变性凝固而沉淀分别.也可以用分散或絮凝的方法是小菌体,细胞,细胞的碎片以及杂蛋白质等胶体离子沉降去除.2.发酵液的基本特性:产物浓度低.具有极性.粘度大.表面张力大.性质不稳定.3.预处理的目的:①.转变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分别固形物的速度,提高固液分别器的效率②.尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）③.去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步骤的操作.4.发酵液预处理的方法:①加热②调整PH值③分散和絮凝④使用惰性助滤剂⑤使用反应剂二固液分别1.方法:①重力沉降②浮透（通气产生气泡,使固体附着在气泡表面除去,用于固液比重差小,直径5-30um颗粒的分别,污水处理.③旋液分别（霉菌和放线菌为丝状菌,体形较大,发酵液采纳过滤的方法;细菌和酵母菌为单细胞,体形较小,其发酵液采纳高速离心分别，如对发酵液采纳预处理,也可用过滤进行固液分别.④介质过滤和离心,工业上比较常用.2.过滤①澄清过滤:过滤介质为硅藻土,砂,塑料颗粒等,适合于固体含量少于0.Ig/lOOml,颗粒直径在5-100um的悬浮液的过漉分别如:河水,麦芽汁,酒类,饮料的澄清.②滤饼过滤:过漉介质为滤布,包括自然或合成纤维织布,金属织布,玻璃纤维纸,合成纤维等无纺布,适合于固体含量大于0.lg∕100ml的悬浮液的过滤分别3常用过滤设施①转鼓真空过滤工艺转鼓真空过滤机的转鼓过滤外壁掩盖有金属丝网,网上掩盖有滤布等过滤介质.转鼓内部区域分了若干独立的扇形区,各有不同的操作功能.该设施主要适用范围:颗粒不太细,粘性不太大的液体.对于青霉素发酵老说,发酵液相对粘稠,因此发酵液质量的优劣,对转鼓处理速度有着明确的影响.转鼓过滤存在使用范围窄,处理力量低的问题.•希得艮空过廉根■作示索②板式过滤工艺原理:依靠过滤推动力与过滤介质两侧的压力差,致使固体积累在滤材上并架桥形成滤饼层,使滤液与不溶的杂质分别.板式过滤机的优点是:结构简洁,制造简洁,设施紧凑,过漉面积大而占地面积小,操作压力高,对各种物料适应力量强,缺点是间歇操作,劳动强度大,生产效率低,适用于间歇操作的场合.①装好过漉板框②检查料浆槽的进出口阀门是否关闭③调好料浆④打开料浆槽的进口和排气阀门,启动搅拌机,料浆槽装满料浆后,关闭料浆槽的进口和排气阀门⑤启动空压机待压力达到指定值后,即可打开进气阀进行测定⑥测定完后,清洗设施,关好电源.③其他预处理的工艺近期消失的超滤膜工艺,由于产生的滤液质量好不断被青霉素生产工艺所采纳,但是使用超滤膜会产生大量不宜处理的菌丝水,不宜进行环境处理,同时能耗较高,给生产成本带来较大的压力,在环保压力不断加大的现实状况下,超滤膜工艺被生产企业渐渐放弃,.而传统的板框处理,转鼓过滤工艺,由于受发酵液性质和发酵液影响,存在速度慢等问题,其生产力量受到了肯定的限制,需要改进生产工艺以适应生产的要求,全自动过滤机由于处理效率高,人工劳动强度小被生产企业所用.4 .其他过滤分别方法①切向流水过滤又称错流过滤交叉过滤和十字流过滤,是一种维持恒压下高速过滤的技术,其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流淌,利于流淌的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走.②双水相萃取向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如:葡萄糖,聚乙二醉）后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另一种高分子化合物从而达到分别和提纯某种高分子化合物的目的.③吸附法向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的,主要的目的是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失.5 .预处理及固液分别技术应用实例以链霉菌发酵液的预处理及固液分别技术为例,其工艺过程如下：1-2倍量水稀释发酵液,pH2∙8∙32加热70-75 酸化处理发酵液冷却,过滤, 板框过滤或离心分别 去提取。
第二章 发酵液的预处理
3、化学变性沉淀法 使蛋白质变性的化学因素有：极端pH、 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。 生产常用的方法： （1）调pH使蛋白质变性沉淀 如在抗生素生产中，常将发酵液pH调 至酸性范围(pH2~3)或碱性范围(pH8~9)使 蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质 较多。
（2）加入有机溶剂、碱金属中性盐、表面活性剂等， 使蛋白质粒子的双电层破坏，而沉淀。 （3）加入化学试剂 pH＜PI，与一价阴离子形成沉淀； pH＞PI，与一些阳离子形成沉淀 蛋白质在酸性溶液中，与阴离子（三氯乙酸盐 等）形成沉淀； 在碱性溶液中，与阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、 Fe3+、Pb2+）形成沉淀。
2、絮凝 （1）机理：絮凝剂主要起架桥作用，即一 个高分子聚合物（絮凝剂）的许多链节分 别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联 接时，形成了较大的絮团。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物， 其相对分子量可达数万至一千万，具有长 链状结构，其链节上含有许多活性官能团。 通过静电引力、范德华力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面。 絮凝剂的结构要求： 一方面要求其分子必须含有较多的活性 官能团，使之能和胶体粒子结合； 另一方面要求有长链的线性结构，以便 同时和多个胶体粒子结合。
三、调整pH法（常用方法） pH直接影响发酵液中某些物质的电解质 和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤 特性。 原理： （1）等电点沉淀法 大多数蛋白质的等电点在酸性范围内 （pH4.0-5.5），利用酸性来调节发酵液pH 使之达到等电点，可除去蛋白质等酸性两 性物质。
（2）在膜过滤中，发酵液中的大分子物 质易于与膜发生吸附，调整pH改变易吸附 分子的电荷性质，减少堵塞和污染。 （3）细胞、细胞碎片及某些胶体物质等 在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大 颗粒，有利于过滤的进行。
发酵液的预处理主要方法
发酵液预处理的主要方法1 加水稀释法和加热法加水稀释法能降低液体粘度， 但会增加悬浮液的体积， 加大后继过程的处理任务。
而且， 单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一 倍，则稀释后液体的粘度必须下降50％以上才能有效提高过滤速率。
加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。
加热可有效降低液体粘度，提高过滤速率。
同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发 酵液的过滤特性。
对于粘度较高的发酵液，稀释或者加热可以降低发酵液黏度，有利于输送和过滤等后续 操作。
史鹏等 [2] 的研究比较了热处理和酸处理两种方法对HA 分子量降低的影响。
2 离心法国内在这方面的报道,主要反映了高速离心能耗大、设备昂贵，因而得不到推广应用。
国内有些厂家仿效国外的做法, 采用高速蝶片式喷嘴离心机分离菌体, 虽对谷氨酸菌体的 除去有一定效果, 但对菌丝较轻细的肌苷菌体至今未取得满意的结果且设备价格昂贵 [3] 。
3 絮凝和凝聚及混凝方法絮凝预处理能显著加快发酵液中固体颗粒的沉降，提高过滤速度。
李凡锋等 [4] 处理 1， 3丙二醇发酵液后， 其中絮凝样的滤饼湿基、 干基重量分别比对照样增加了41.13%、 51.88%。
江龙法等 [1] 采用壳聚糖作为絮凝剂对 L 乳酸发酵液进行预处理,取得了较好的结果。
经处理后的发酵液菌体减少95 %以上, 江龙法等 [5] 用壳聚糖作絮凝剂处理谷氨酸发酵液，谷氨酸浓度没有降低。
周荣清等 [6] 的研究证明:透明质酸发酵液经絮凝预处理后,不仅可以大大改善发酵液的固液分离效果,同时其滤清液的纯度亦有一定幅度的提高,在超滤过程中污染程度明显减少, 渗透通量增加。
4 调节 PH值调节pH值可以改善发酵液吸附性质和使蛋白变性。
对于加入离子型絮凝剂的发酵液， 调节pH可改变絮凝剂的电离度， 从而改变分子链的伸展状态。
发酵液的预处理和菌体的回收
缺点：
热处理常常会对发酵液质量有些影响，特别是会使 色素增多。而且，温度升高常使发酵液中的一些水解酶活 力升高，被分离产物有受酶水解的危险。 因此，热变性最好在硫酸铵溶液中进行，另外，选择 合适的缓冲液、pH、加热方式和加热过程也很重要。
新进展：
为了提高产物在下游分离过程中的活力稳定性，人们对耐
对产品的影响
试剂可能进入产品
基本无影响
4. 加入惰性助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏
高温型的基因工程产品（如蛋白酶等）的关注日益加强，不
断有耐高温的产品出现，这也使得采用升高温度的处理方法
可行性和可操作性更强。而且，原来为了防止产品失活而消
耗的制冷能耗也可以节省，并简化了分离步骤。
极端微生物 嗜热微生物产生的耐高温酶
2. 调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷
性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。
在相距胶核表面约一个 离子半径的Stern平面 以内，正离子被紧密束 缚在胶核表面，称为吸 附层或紧密层；
在stern平面以外，剩余的正离子 则在溶液中扩散开去，距离越远， 浓度越小，最后达到主体溶液的平 均浓度，称为扩散层。
当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体随着
它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移面
不带电荷的非离子型基团。
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈
地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶
粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就
是絮凝作用。
高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图
工业上使用的絮凝剂
P30
生物物质分离工程考试重点
题型：问答简答综合内容1.固液分离（沉降、离心、过滤、膜分离）比较，适用对象2.液-液传质分离（萃取、双水相、反胶束、超临界、泡沫分离）3.如何减少，避免失活问题双水相反胶束4.分离原理适用对象特点5.细胞破碎特点3.发酵液的预处理和菌体的回收（为什么进行预处理；预处理方法；过滤器的主要特点）3.2悬浮液的预处理（原因）原因：1.产品在培养液或菌体中浓度低2.产品与许多杂质混在一起3.非牛顿型流体目的：1.改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中分离固形物的速率，提高固液分离器的效率。
2.尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液相）。
3.去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。
方法：1.加热法：①降低粘度②提供能量，促进细胞聚集③破坏凝胶结构——利于细胞聚集2.调节pH：①细胞聚集与pH值有关②简便，降低粘度③如何保持pH局部值不过高/低3.凝聚：（无机类电解质或高分子物质）表面电荷的简单中和，消除双电层，产生氢键结合。
4.絮凝：使用絮凝剂（天然或者合成的大分子量聚电解质以及生物絮凝剂）将胶体粒子联网，絮凝剂起架桥作用。
5.使用惰性助滤剂：一种颗粒均匀质地坚硬不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围。
3.4过滤法（主要特点型号）定义：过滤是迫使液体通过固体支撑物或过滤介质，把固体截留，从而达到固液分离的目的。
常用新型过滤器：1.真空过滤器：转鼓（优点：用于大规模生物分离的主要过滤设备，可以分离较难过滤的悬浮固粒，劳动强度小；缺点：表面利用率低，洗涤效果差，滤饼卸料时易剥落；滤布更换困难，不便观察）水平带式（优点：处理量大，操作灵活，洗涤效果好；占地面积大；缺点：有效过滤面积小，投资较高）水平圆盘（大型化，洗涤效果好）水平回转翻盘（大型化，适用于过滤密度大，浓度高的粗颗粒悬浮液）2.压滤器（适用于固含量高难处理的细颗粒料液）：板框压滤器加压叶滤器气压罐式连续压滤器带式压滤器3.错流过滤：料液给过滤介质表面一个平行的大流量的冲刷，则过滤介质表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通过过滤介质的流速则比较小。
发酵液预处理
第三章发酵液预处理从微生物发液中提取发酵产品的第一步骤就是预处理，其目的的不仅在于分离菌体和其他悬浮液的性质，以利用于提取和精制后断各工序的顺利进行。
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都有含有。
–对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；–对于胞内产物，则首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。
第一节发酵液过滤特性改变微生物发酵液的特性可归纳为：发酵产物浓度较低，大多为1%～10%，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大：固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
一、降低液体粘度降低液体粘度的常用方法有加水稀释法和加热法等。
采用加水稀释虽然降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。
若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。
升高温度可有效降低液体粘度，提高过滤速率，如12ºBe 麦芽汁40℃时粘度为1.2×10-3Pa·s，升高到75℃其粘度可下降一半，过滤速率可加倍。
同时，在适当温度和受热时间可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。
如链霉素发酵液，调酸至pH3.0后。
加热至70℃，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可增大10~100倍。
使用加热时必须严格控制加热温度与时间。
二、调整pH⏹pH值直接影响发酵液中某些物质有电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。
⏹对于氨基酸、蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下，净电荷为零，称为等电点下，两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法提取谷氨酸。
发酵液的预处理讲解
这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
影响絮凝效果的因素：
1) 絮凝剂浓度（用量） 2) 絮凝剂分子量 3) 絮凝剂类型 4) 溶液的pH 5) 搅拌速度和时间 6) 助凝剂
Ga2+：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷 酸盐，生成磷酸钙
Mg2+：加入草酸（沉淀不完全）；加入磷酸盐， 生成磷酸镁；三聚磷酸钠（Na5P3O10），生成可 溶性络合物
Fe3+：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀
二、 发酵液的过滤
发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的 固体培养基成分，过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒 与液体进行分离的过程。 定义：
它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别 吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团， 这就是絮凝作用。
絮凝剂
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴 离子型(含有羧基)和阳离子型(含有胺基)三类。
A. 聚丙烯酰胺类衍生物 B. 聚苯乙烯类衍生物 C. 无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。 D. 天然有机高分子絮凝剂：多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，
在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中 的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。
1.过滤介质
使滤液通过，截留固体颗粒并支撑滤饼的材料。 要求其具有多孔性、耐腐蚀性及足够的机械强度。
工业常用的过滤介质：织物介质、多孔性固体、 粒状介质。 无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等
成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘 结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。
第二章 发酵液的预处理和固
二、发酵液的预处理（续）
调整pH（预处理中较常用方法）： – pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电 荷性质，调节pH可改善其过滤特性； 如调液pH值使蛋白质等达到等电点以除去；膜 过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附， 调pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵 塞和污染。 – 调pH时，选较温和的酸或碱，防止局部过酸、 过碱。常用草酸
选择和使用助滤剂要点
根据目的产物选择助滤剂品种；
根据过滤介质和过滤情况选择助滤
剂品种； 粒度选择：
– 与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应。
使用量选择： – 与悬浮液中固形物含量相等，过滤速 度最快。
二、发酵液的预处理（续）
加入反应剂：
– 加入某些反应剂（不影响产物），利 用反应剂和某些可溶性盐类发生反应 生成不溶性沉淀。 –作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结， 使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作 为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物 凝固，消除发酵液中某些杂质对过滤 的影响，从而改善过滤性能。
第二节 发酵液的固液分离
固液分离的目的：
– 收集胞内产物的细菌或菌体，分离除 去液相； – 收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物； 固液分离的方法：离心分离、过滤、分 离筛、重力沉降、浮选分离。
不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法 霉菌和放线菌发酵液：过滤方法 细菌和酵母菌发酵液（未经预处理）：高速离心。 细菌和酵母菌发酵液（进行预处理）：过滤方法。
举例：如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝 和添加助滤剂等方法进行预处理后，即可用板 框过滤机或带式过滤机进行菌体分离
一、影响固液分离的因素
发酵液中细胞或菌体、各种悬浮粒子的
大小和形状：
发酵液预处理
2.3 发酵液杂质的去除
在预处理时，应尽量除去高价无机离子、杂蛋白等。 2.3.1无机离子的去除 （1）钙离子的去除 在发酵液中加入草酸。作用：1 除去钙离子；2 去除部分镁离子; 3 同时草酸可酸化发酵液，使发酵液的胶体状态改变，有助于目 标产物转入液相。由于草酸的溶解度较小，用量大时可用其可溶 性盐(如草酸钠)。4 反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提 高滤液质量。 缺点：草酸的价格较高，如果回收利用可以降低成本。例如：在 四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60℃下反应生成草酸铅，草 酸铅在90～95℃下用硫酸分解，再经过滤、冷却、结晶操作后即 可回收草酸。
2.5.5絮凝的优化
选择使用何种絮凝剂要综合考虑成本、可行性、 毒性等多方面因素。此外，絮凝效果与絮凝剂 的加入量、分子量和类型，溶液的pH、搅拌 速率和时间等因素有关。 加入助凝剂可以增加絮凝效果。 剪切力及处理时间(添加絮凝与进一步分离之 间的间隔时间)也是很重要的优化参数。
絮凝的优化流程为：①准备好所需的絮凝剂及化学试 剂；②分别向烧杯中倒入500～1000mL的悬浮液试样； ③搅拌(桨叶速率可为200r／min)；④通过加酸或加碱 调节每个试样的pH值(例如，如果有6个试样，则分别 使其pH值为4、5、6、7、8和9)；⑤同时向各烧杯中 加入助凝剂，并开始计时；⑥继续保持高搅拌速率 5min；⑦加入絮凝溶液，于1min内混合均匀；⑧降低 搅拌速率(例如降至50r／min)保持15min；⑨分析絮凝 结果(可通过静置或过滤等方法)
发酵液的预处理和菌体的回收
发酵液的预处理和菌体的回收发酵液是指在一定条件下，通过微生物发酵后所得到的液体产物。
它富含各种有机物质和微生物菌体，通常被广泛应用于食品工业、医药工业以及环境保护等领域。
然而，在发酵液的应用过程中，发酵液的预处理和菌体的回收是非常重要的环节。
本文将重点讨论发酵液的预处理和菌体的回收技术。
一、发酵液的预处理发酵液在发酵过程中产生了丰富的有机物质和微生物菌体，为了提高发酵液的质量和纯度，需要进行适当的预处理。
常见的发酵液预处理方法包括离心、超滤、加热杀菌等。
1. 离心离心是将发酵液置于离心机中进行离心分离。
离心可以有效地分离出发酵液中的固体颗粒，如微生物细胞和沉淀物等。
离心速度和时间的选择应根据发酵液的特性来确定，以确保最佳的分离效果。
2. 超滤超滤是利用滤膜的孔隙大小将发酵液中的溶质分离出来。
超滤可以去除发酵液中的胶体、蛋白质等大分子物质，同时维持较高分子量的活性物质的存在。
超滤技术操作简单，适用于连续生产中。
3. 加热杀菌加热杀菌是通过高温处理来灭活发酵液中的微生物。
加热杀菌可以有效地消除微生物的活性，并保证发酵液的稳定性和长期保存。
需要注意的是，在加热杀菌的过程中，要控制好温度和时间，以避免对发酵液中的活性物质造成破坏。
二、菌体的回收菌体的回收是指将发酵液中的微生物菌体从液体中分离和提取出来的过程。
菌体的回收主要包括离心、过滤、洗涤等步骤。
1. 离心回收离心回收是通过离心机将发酵液中的微生物菌体与液体分离。
离心速度和时间的选择应根据菌体的大小和密度来确定，以保证最佳的分离效果。
2. 过滤回收过滤回收是通过滤膜将发酵液中的微生物菌体截留在滤膜上，使其与液体分离。
过滤回收可以采用不同孔径的滤膜，根据菌体的大小选择合适的滤膜孔径，以提高分离效果。
3. 洗涤回收洗涤回收是将分离出来的微生物菌体进行洗涤，以去除发酵液中的残留有机物质和杂质。
常用的洗涤液包括缓冲液、蒸馏水等。
洗涤的目的是提高菌体的纯度和质量。
第三章发酵液预处理介绍
第三章发酵液预处理介绍第一节发酵液预处理的意义发酵液预处理是指在微生物发酵过程中对发酵液进行一系列阶段性加工处理的过程，其目的是为了提高发酵液的品质和产量，并为后续的纯化和提取工艺提供更好的条件。
发酵液中包含有各种生物活性物质，如细胞酶、蛋白质、多糖、有机酸等，这些物质的存在对发酵液的利用和后续处理造成了一定的困难。
因此，在发酵过程中，通过一系列预处理措施的引入，能够有效地提高发酵液的品质，使得后续的纯化、分离和提取工艺更加顺利进行。
第二节发酵液预处理的主要方法1.发酵液的过滤在发酵过程中，微生物会产生大量的菌体、代谢产物等物质，通过过滤可以将这些悬浮在发酵液中的物质进行分离。
过滤可以采用不同的方法，如微孔滤膜、滤布、滤纸等，根据发酵液中悬浮物质的大小和特性选择合适的过滤方式。
2.发酵液的沉淀通过沉淀可以将发酵液中的颗粒物质和胶状物质分离出来，常用的沉淀剂包括铝盐、聚合物等。
沉淀剂的选择需要根据发酵液的特性来确定，同时需要考虑沉淀剂的剂量和沉淀时间等因素。
3.发酵液的调节发酵过程中可能会出现pH值过高或过低的情况，需要进行调节。
通常采用的方法是加入酸碱，将发酵液的pH值调节到适宜的范围内。
同时，还可以通过添加营养物质，如氮源、磷源等，来调节发酵液中的营养成分。
4.发酵液的浓缩发酵液中的微生物和代谢产物通常是以溶液的形式存在，为了将其纯化和提取，需要将发酵液进行浓缩。
常用的方法包括真空浓缩、膜浓缩等，根据发酵液的性质选择合适的浓缩方式。
第三节发酵液预处理的应用案例1.青霉素的生产青霉素是一种重要的抗生素，用于治疗各种感染病症。
青霉素的生产过程中，需要对发酵液进行一系列的预处理。
首先，通过过滤将发酵液中的微生物和悬浮颗粒物进行分离。
然后，采用酸碱调节的方法，将发酵液的pH值调节到适宜的范围。
最后，通过真空浓缩将发酵液中的青霉素进行提取和纯化。
2.乳酸的生产乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
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注意事项：严格控制加热温度与时间。首先，加 热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围 内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞 内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物 分离与纯化。
根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如 下三类： (1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚 苯乙类衍生物。 (2)无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。 (3)天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻 酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
影响絮凝效果的因素
絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类 型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。
胶体双电层的构造
凝聚作用就是向胶体悬浮液中加 入某种电解质，在电解质中异电 离子作用下，胶粒的双电层电位 降低，使胶体体系不稳定，胶体 粒子间因相互碰撞而产生凝集 （1mm左右）的现象。
Al3+>Fe 3+ >H+> Ca2+> Mg2+ >K + >Na + >Li + 。
常用的凝聚电解质有硫酸铝(明 矾)、氯化铝、三氯化铁、硫酸 亚铁、石灰、硫酸锌、碳酸镁等。
尺寸（m× m)
<0.4 × 0.4
1 ×2
7 ×10
40 ×40 100 ×100
尺寸增加 回首费 用增加
1-10丝网状
100 ×100
发酵液的预处理
发酵液的预处理目的和内容： ① 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离 固形物的速度，提高固液分离器的效率； ② 分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂 质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各 工序的顺利进行。 发酵液的预处理主要包括： ①发酵液过滤特性的改变； ②相对纯化。
第二章 发酵液的预处理和菌体的回收
固体颗粒沉降速度
vg
d
2 p
(
S
L)g
18 L
S 为固体密度
L 为液体密度
d p 为固体颗粒直径
L 为液体黏度 g 为重力加速度
与固液分离相关的微生物发酵液特性： ①发酵产物浓度较低，大多为1％～10％，悬浮液中大部
分是水，处理体积量大；
②各类细胞的颗粒小，相对密度与液相相差不大；
滤饼的过滤速率
dQ dt
L
Ap
Rm
RC
A 过滤面积
பைடு நூலகம்p 操作压
L 滤液的黏度
Rm 介质阻力 RC 滤饼阻力
1 降低液体粘度
① 加水稀释法：能降低液体粘度，但会增加悬浮 液的体积，加大后继过程的处理任务。而且，单从过 滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加 水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的 粘度必须下降50％以上才能有效提高过滤速率。
滤饼的过滤速率
dQ dt
L
Ap
Rm
RC
A 过滤面积
p 操作压
L 滤液的黏度
Rm 介质阻力 RC 滤饼阻力
（一）发酵液过滤特性的改变
目的：通过对发酵液进行 适当的预处理，即可改善其 流体性能，降低滤饼阻力， 提高过滤与分离的速率。
方法：调酸(等电点)、热 处理、电解质处理、添加凝 聚剂、添加表面活性物质、 添加反应剂、冷冻—解冻及 添加助滤剂等。
助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介 质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液， 也可两种方法同时兼用。
助滤剂使用要点
2 调整pH pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电
荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。此法是 发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。
如利用酸碱性来调液pH值使蛋白质等两性物质 达到等电点得以除去。又如过滤中，发酵液中的大 分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸 附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
细胞组成
类型 细菌
蛋白质 （%）
40-70
酵母
40-50
丝状真菌 10-25
藻类
10-60
核酸（%）多糖（%）类脂物 （%）
13-34 2-10
10-15
4-10
<15
1-6
1-3
<10
2-9
1-5
<15
4-80
3 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细 胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散 状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提 高过滤速率。除此之外，还能有效地除 去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。 因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用 的预处理方法之一。常用于菌体细小而 且粘度大的发酵液的预处理。
阳离子型高分子絮凝剂 ?
带负电荷的菌体 或蛋白质
?
非离子型和
阴离子型高分子絮凝剂
?
电解质
+
非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂
包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。
4 加入助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使 滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增 大。
常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、 珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的 是硅藻土。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下， 基于桥架作用，当一个高分子聚 合物的许多链节分别吸附在不同 的胶粒表面上，产生桥架联接时， 形成粗大的絮凝团（10mm）的过 程。絮凝是一种以物理的集合为 主的过程。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合 物，其相对分子质量可高达数万 至一千万以上，它们具有长链状 结构，其链节上含有许多活性官 能团，这些基团通过静电引力、 范德华引力或氢键的作用，强烈 地吸附在胶粒的表面。
絮凝剂的化学结构
1. 要求其分子必须含有相当多的活性官能 团，使之能和胶粒表面相结合； 2. 具有长链的线性结构，以便同时与多个 胶粒吸附形成较大的絮团， 3. 相对分子质量不能超过一定限度，以使 其具有良好的溶解性。
絮凝剂的分类
根据其活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分 为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。
③细胞含水量大，可压缩性大，一经压缩就会变形；
④流变特性复杂，液相粘度大，吸附在滤布上；
⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物 污染、蛋白酶水解等作用的影响。
⑥动植物细胞没有微生物细胞耐剪切，不适于离心。 因此，这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难。
工业技术中典型的固体粒子
固体粒子的类型 细胞碎片 细菌细胞 酵母细胞 哺乳动物细胞 植物细胞 真菌菌丝或丝状 细菌 絮凝物