液相色谱简介

载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，苯基 C8适于分离蛋白质
2. 液固色谱法

以固体吸附剂如硅胶、氧化铝等为固定相的液相色 谱法。竞争吸附机理。 以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷、甲醇、 水等溶剂调节合适的洗脱强度或进行减活。 用于中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃


等，不同极性取代基的化合物，结构异构体和几何
异构体混合物的分离。
应用举例
3. 离子对色谱法

在流动相中加入与样品离子电荷相反的离子（称为对 离子或反离子），使其与样品离子结合生成弱极性的 离子对（中性缔合物）的分离方法。 固定相与流动相多与反相键合相相同
离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正 离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等
2．梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间；
强溶剂 A%
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5
2
予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。
流动相的优化
流动相的优化主要是考察流动相组成对保留 时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离 选择性；保持流动相的低粘度, 从而保证高的 柱效。 在吸附色谱中混合溶剂选择规则： 混合溶剂中
极性强的组分含量大或小时 , 有最大的 值；能与溶
高效液相色谱仪
高压输液系统
往复泵原理示意图
进样系统
六通进样阀结构示意图
分离系统——色谱柱
包 括 柱 体 和 固 定 相 两 部 分
HPLC色谱柱及其填料的特征

HPLC 色谱柱的基质材料


硅胶
聚合物

色谱柱结构
常用HPLC填料种类
多 孔 微 球 灌 流 色 谱
薄 壳 型
整 体 柱
硅胶基质材料

需要专用的离子色谱仪 分析无机阴离子的首选方法，还可用于分析无机阳 离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。
离子色谱仪的流程
应用举例
5. 离子交换色谱

以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂
作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的 不同而得到分离的方法
常用的离子交换树脂



葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25， CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂
7. 疏水作用色谱
(Hydrophobic Interaction Chromatography）
Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity
Si 固 定 相 表 面 O Si O Si O OH OH C18H37SiCl3 OH 固 定 相 表 面 O Si O Si O O O Si C18H37 Si O
采用键合相为固定相的方法：
疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等 极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
化学键合相色谱法的分类：
涡流扩散项
纵向扩散
流动相传质
滞留区传质
固定相内传质
对速率方程的讨论

选用细颗粒填料可获高柱效
流动相流速低，有利于达到高柱效
选用黏度小的流动相有利于提高柱
效

温度的影响
柱外效应

由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
三、高效液相色谱仪
高效液相色谱仪流程
Mechanism of HIC
A 280
0.04 AU
Na2SO4 1.0 M
疏 水 层 析 操 作
8. 亲和色谱
（Affinity chromatography）
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
高效液相色谱法
HPLC
一、高效液相色谱法的特点
GC 应用范围 HPLC
热稳定、低沸点的 热不稳定、高沸点、 物质 离子型的物质
热力学理论
分析成本 分离能力
较成熟
低 与柱的类型有关
发展中
高 较高
经典液相色谱法 粒径(μm) 75-600
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
柱前压力(atm)
分析时间 (h) 色谱柱长度(cm) 柱效(块/m) 样品用量(g)
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测；
（3）增加峰容量；
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留 在柱上, 保持柱性能长期良好； （ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一 段平衡时间；不同溶剂的 UV吸收程
度稍有差异, 可能会引起基线漂移。
凝胶色谱填料

葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列

聚丙烯酰胺凝胶
Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列

分子筛凝胶色谱原理
Desalting proteins
proteins salts
应用举例
1.聚乙二醇40000 2.聚乙二醇10000 3.聚乙二醇3000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇

正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的 极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极 性化合物。 反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的 极性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。 应用最广泛

反相液相色谱

反相液相色谱基于组分的疏水性，因此 通常采用非极性的烷基固定相作为填料， 其表面化学性质和流动相的选择应最大 限度地满足疏水的要求
聚合物基质材料

交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯等。 pH 稳定性好：pH 1－ 13。 可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子 交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。 在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。 填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。 分离效率相对硅胶而言比较低 重现性不好

Source 系列离子交换剂


特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低
阳离子交换树脂 S系列
阴离子交换树脂 Q系列
MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相 同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列
硅胶基质固定相，主要用于分析多肽、蛋白质、核 酸、多糖等。

使用有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱法 (GPC) ， 高密度聚苯乙烯二乙烯苯固定相，主要用于高聚物
（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定
凝胶渗透色谱分离原理图


在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流 经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以 分离 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低
1.
2. 3.
目前应用最为广泛的基质材料。
高机械强度和高的比表面积。 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交 换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。
4. 5. 6. 7.
高效。 重现性好。 pH 适用范围为pH 2－8。 具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。
Source RPC

Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase
6. 体积排阻色谱法（SEC）

以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径， 使样品中不同分子大小的组分得以分离。 用于分离分子大小差大于10%的样品 大分子的分离分析，聚合物分子量分布的测定

分类

使用水溶液为流动相的凝胶过滤色谱法（GFC ），
Often need spacer arm
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
亲和色谱分离原理
Competitive elution


流动相的选择原则
分析柱 微孔柱 半制备柱 制备柱
Influence of Particle Size on the Separation effect
30µ m
15µ m
5µ m
填料直径与压力、保留时间的关系
压力与制备量的关系
5．检测系统

紫外检测器(UV) 示差折光检测器(RI) 荧光检测器 蒸发光散射检测器(ELSD) 电导检测器
（1）紫外检测器

固定波长的紫外检测器


可变波长的紫外检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器之三维图
响应特性

选择性检测器，如芳烃类化合物的检测
灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器
溶剂具有稳定的化学性质
溶剂的选择与使用的检测器要有相容性
溶剂的粘度要小
溶剂的沸点不能太低
溶剂的纯度要高且价格便宜

正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等， 己烷为主体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，
质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷

反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合 物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给
（5）电导检测器
结构
响应特性

选择性检测器，对离子型化合物有响应
灵敏度高 受温度的影响 不能梯度洗提
四、HPLC的主要类型

化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法
HPLC固定相分离原理
根据样品性质选择固定相和流动相
分离模式的选择
1. 化学键合相色谱法
（2）示差折光检测器
结构
响应特性

通用性检测器
低灵敏度
基线易受温度的影响
不适合梯度洗提
（3）荧光检测器
结构
响应特性

选择性检测器。如PAH，蛋白质
高灵敏度，比紫外高约1000倍
适合梯度洗提
（4）蒸发光散射检测器
结构
特点

通用检测器 灵敏度高 可梯度洗脱 响应与质量有关


有机酸、有机碱特别是强酸、强碱的分析，如羧酸、 磺酸、胺类、酚类、药物、染料等
应用
4. 离子色谱法

采用离子交换剂为固定相的方法，固定相可分为强 酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型 （羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺） 流动相：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3

等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3
质发生氢键作用的溶剂, 有较好的分离选择性。
梯度洗脱技术
梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成 来调整组分的k’值，改变分离因子α值，以达到 最短时间内得到最佳分离的目的。 为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？
在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的 黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。
0.01-1.0
1-20 50-200 2-50 1-10
20-300
0.05-1.0 2-30 104-105 10-6-10-2
高效液相色谱法的特点

wenku.baidu.com
高压
高速 高效 高灵敏度
HPLC分离过程示意图
二、高效液相色谱理论基础
高效液相色谱中的速率方程
2 2 Cm d p Cs d p Cs d 2 Cd Dm f H 2d p ( )u u Dm Dm Ds

聚合物形态
印迹聚合物
HPLC 色谱柱的构成
类 型 内径D (cm)
0.3 – 0.46 0.1, 0.21 0.8 – 1.0 2.0 – 5.0
柱长(cm)
3 - 25 15, 25 10 - 25 10 - 25
粒径 (µ m)
3 - 10 3 - 8 5 - 20 5 - 20