稀少精子冷冻技术
实验室常用猪精液的低温保存方法
实验室常用猪精液的低温保存方法
一、冷冻保存
冷冻保存是猪精液最常见的保存方法之一。
在冷冻保存之前，需要对猪精液进行初步处理。
需要保持猪精液的干净和纯净，避免杂质的混入。
将处理好的猪精液放入专用的冷冻管中，然后将冷冻管放入冷冻盒中。
接着，将冷冻盒放入专用的冷冻机中，进行冷冻保存。
在冷冻保存的过程中，需要控制温度和湿度，避免冷冻温度过高或者过低，以免影响猪精液的质量。
冷冻保存方法能够长时间保存猪精液，并且保持猪精液的活力和质量，适用于长时间保存和远距离运输。
二、液氮保存
液氮保存方法能够更好地保持猪精液的质量和活力，可以长时间保存，并且适用于大规模的保存和长时间的保存需求。
液氮保存需要特殊的设备和条件，并且保存、运输和使用过程中需要更加小心谨慎，否则会影响猪精液的质量。
三、干冰保存
干冰保存是一种中等程度的低温保存方法。
在干冰保存之前，同样需要对猪精液进行初步处理。
然后将处理好的猪精液装入专用的干冰盒中，接着将干冰盒放入专用的冷冻设备中进行保存。
干冰保存方法能够较长时间地保存猪精液，并且适用于一般实验室的保存需求。
它比液氮保存更为便捷和易行，但是保存时间相对较短。
实验室常用猪精液的低温保存方法有冷冻保存、液氮保存和干冰保存等多种方式。
不同的保存方法适用于不同的实验需求和实际情况，实验室人员需要根据实际情况进行选择和使用。
在保存猪精液的过程中，需要注意保持猪精液的纯净和完整，控制保存温度和湿度，以及避免受到外界因素的影响，以确保保存的猪精液的质量和活力。
希望本文对实验室人员在猪精液保存方面有所帮助。
鸡精液保存技术的研究进展
572023.6中，能够促使鸡蛋的蛋黄沉积并降低其病死率。
在獭兔日粮中分别添加0.1%、0.15%复合酸化剂，獭兔腹泻率和死亡率明显下降。
随剂量的增加，复合酸化剂对肉兔的生长性能和病死率的作用接近抗生素的效果。
3 复合酸化剂对猪生产性能的影响3.1 复合酸化剂对猪生长性能和腹泻率的影响在猪自由采食时，猪的采食量直接影响其生长性能的高低。
许多报道显示，复合酸化剂可以提升日粮的适口性，采食量增加。
研究者在断奶仔猪中添加0.15%酸化剂，其日增重有所增加，腹泻率下降22%。
研究人员在断奶仔猪饲料中添加不同酸化剂，显示酸化剂在提升生长性能和降低腹泻率方面有显著影响。
3.2 复合酸化剂对猪肠道微生物的影响在酸性条件下，致病菌的生长受到一定抑制，有益菌增殖速度较快。
有报道，将不同的有机酸添加至仔猪的日粮中，各组产气荚膜杆菌和大肠埃希菌的增殖均受到抑制。
饲喂酸化剂后，检测仔猪粪便，沙门氏菌和大肠埃希菌数量明显减少，乳酸菌含量约为复合抗生素组的2倍。
将0.2%山梨酸添加至母猪日粮中，对仔猪哺乳期窝重有促进作用。
产前7日在母猪日粮中添加丙酸、乙酸复合酸化剂，对哺乳期三元杂交母猪采食量无明显改善，但2000毫克/公斤组蛋白质消化率高于对照组3.43%。
3.3 复合酸化剂对猪免疫功能的影响猪血清中血清总蛋白、白蛋白和球蛋白可以反映蛋白质代谢水平与猪机体健康状况。
投喂复合酸化剂的仔猪，血清中白蛋白含量显著增加。
研究表明，仔猪日粮中添加0.1%复合酸化剂后，显著提高血清总蛋白和球蛋白水平。
研究显示，饲喂添加酸化剂后，仔猪血液IgG水平显著提升，但IgM含量无显著变化。
由柠檬酸、甲酸、苯甲酸、磷酸、富马酸、甘蔗糖蜜、乙酸和丙酸制成的复合酸化剂组与复合抗生素组相比，血清IgM含量提高34.8%，提升断奶仔猪的免疫功能。
3.4 复合酸化剂对母猪初乳品质的影响在新生仔猪的生长过程中，初乳的免疫作用极其重要。
新生仔猪体内能力储备量少，其应对环境的变化，需耗费大量能量，新生仔猪断奶前能量来源为母乳，母乳品质高低对仔猪成活率产生直接影响。
精液冷冻储藏技术掌握精液收集处理和储存的方法
精液冷冻储藏技术掌握精液收集处理和储存的方法精液冷冻储藏技术是一项重要的生物技术，它可以帮助人们保存和储存精液。
无论是用于人类繁殖技术还是动物繁殖技术，精液冷冻储藏技术都发挥着重要的作用。
本文将介绍精液收集、处理和储存的方法。
一、精液收集方法精液的收集是精液冷冻储藏的第一步，它要求采用合适的方法来保证收集到高质量的精液样本。
1. 人类精液收集方法:人类精液的收集通常采用自慰法。
收集器宜选用干净的容器，确保不会对精液样本产生污染。
在收集的过程中，应保持良好的心态和放松的状态。
2. 动物精液收集方法：动物的精液收集可采用人工授精法、人工阴道法等多种方法。
具体方法需要根据不同动物的特点来确定。
二、精液处理方法精液的处理是为了去除其中的杂质，提高精液的质量。
1. 离心法：通过离心分离法，可以将精液中的不碳水化合物、细胞和其他杂质去除，提高精液的纯度。
离心的速度和时间需要根据精液的浓度和特性来确定。
2. 过滤法：通过过滤器过滤精液，使其中的颗粒和污染物被过滤掉，确保精液的干净和纯度。
三、精液储存方法精液储存是精液冷冻储藏技术的最后一步，它是为了确保精液的长期保存和保存质量。
1. 液氮储存：液氮储存是当前最常用的精液储存方法之一。
将处理好的精液样本放入液氮罐中，保持温度在零下196摄氏度，确保精液的长期保存。
2. 冷冻储存：冷冻储存是另一种常用的精液储存方法。
将处理好的精液样本放入冷冻管中，通过快速冷冻和在低温下保存，确保精液的保存质量。
总结：精液冷冻储藏技术是一项重要的生物技术，它可以帮助人们保存和储存精液，无论是用于人类繁殖技术还是动物繁殖技术。
在进行精液冷冻储藏之前，需要准确掌握精液收集、处理和储存的方法。
精液冷冻储藏技术的正确应用将对人类和动物的繁殖事业产生积极的影响。
实验十五精液的冷冻保存
实验十五精液的冷冻保存一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：3～4人二、实验目的要求精子具有受温度变化直接影响本身活动力和代谢能力力的生物学特性。
利用这一特性，将精液特殊处理后，保存在超低温下，精子代谢活动完全受到抑制，停止能量消耗，处于生命静止状态，长期保存下来。
一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
要求同学们了解精液冷冻保存的技术操作过程和精液冷冻保存原理，初步学会冷冻保存方法。
三．实验原理冰晶化是水在降温过程中的一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶。
冰晶可造成精细胞（精子）内外的溶质浓度和渗透压增高，引起细胞内脱水、原生质变干、酸碱失去平衡、细胞膜和顶体以及整个组织和结构破坏等致死性伤害，最后导致精子发生不可逆的变化而死亡。
一般精液内含85%～95%的水分，精子内也含有及少量的水分，这些水分在降温过程中在-0.6～-60℃温度区内缓慢降温能形成冰晶。
降温速率越慢，所形成的冰晶越大，其中特别以-15～-25℃时冰晶形成最多。
在冷冻精液过程中只有避开这个有害温度区，才能得以长期保存。
快速升降温度的办法，难以达到完全玻璃化冻结条件。
为此，在制作冷冻精液的稀释液内，要加入一定量的甘油等抗冻害物质。
甘油具有极强的亲水性，可限制水分子形成冰晶而处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，即缩小精子的有害温度的上限。
此外甘油容易渗透精子内，可降低渗透压改变的不良影响及营养作用等，增强精子的抗冻害能力和无冻害生存环境。
精液在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶，精子能否生存的关键在于冰晶的大小，冰晶越大对精液伤害越大，反之冰晶越小，伤害越小甚至无损伤。
因此，只要避免大冰晶形成，并使精子稳定在微晶的状态下，一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
四．实验材料和仪器精液、2.9%的柠檬酸钠溶液、50～100ml烧杯、滴管、10 ml试管、低温温度计、20～80目纱网、漏勺、灭菌纱布袋、液氮罐、液氮、载玻片、盖玻片、显微镜、保温箱。
精液的冷冻保存课件(共21张PPT)《畜禽繁殖与改良》
小结
精液冷冻保存的意义
精液的冷冻保存
精液冷冻保存原理精液冷冻技术Fra bibliotek液态→固态
结晶态：缓慢降温形成。水分子有序形成 冰晶对精子有害：机械和渗透压损伤。
（0～-60℃ ）（ -15～-25℃）
玻璃态：快速降温形成。水分子无序形成 玻璃样的超微粒结晶，对精子无害
（ -60～-250 ℃ ）
• 玻璃化是可逆的，不稳定的，当缓慢升温时又可能形成冰晶化。
3精液冷冻技术
8
三、精液冷冻技术
2精液冷冻保存的原理
5
二、精液冷冻保存的原理
利用超低温使精液和精子快速冷冻，快速越 过形成冰晶的温度范围（0～-60 ℃）、精液或 精子中的水分不形成冰晶，而是形成玻璃化。同 时在抗冻剂的存在下使精子免受冻伤，在温度上 升至体温精液解冻后精子能够保持完整的形态结 构、功能和受精能力。
二、精液冷冻保存的原理
0.08亿÷0.25mL=0.32亿/mL 细管冻精精子密度为：
0.32亿/mL÷0.35亿/mL=0.914亿/mL 稀释倍数为：
13.8亿/mL÷0.914亿/mL≈15(倍)
三、精液冷冻技术
➢ 精液稀释 • 稀释液的配制
三、精液冷冻技术
精液稀释
两次稀释法：缩短甘油与精子接触的时间，甘油添加量5%-7%
三、精液冷冻技术
精液分装
0.25mm细管冻精
精液分装机
三、精液冷冻技术
冷冻精液
三、精液冷冻技术
冷冻精液
三、精液冷冻技术
活率检查
冻精解冻
细管型：直接将其投入到38-40℃的温水中，待冻精融化到一半时，立即取出备用。
三、精液冷冻技术
保存精液
冷冻精液技术的研究
冷冻精液技术的研究作者：刘新娥来源：《农业开发与装备》 2012年第6期刘新娥（新疆阜康市职业中等专业学校，新疆阜康 831500）摘要：品种改良必须有良法，俗话说“母畜好，好一线，公畜好，好一坡”，这充分说明了公畜在繁殖改良中的重要作用。
冷冻精液和人工授精（AI）的推广，就可以大大提高优良种畜的使用价值。
在我国20世纪30年代就开展了人工授精技术，70年代中期进行了冷冻精液的研究。
家畜冷冻精液研究的成功，使人工授精技术又有了新的发展。
冷冻精液不受时间、空间和种畜寿命的限制，可以最大限度地发挥优良种畜的作用。
因此，人工受精技术就成了一门全新科学技术，冷冻精液技术就至关重要。
关键词：精液品质；稀释液；冷冻精液1 精液品质的鉴定1.1 鲜精质量评定1.1.1 肉眼。
从射精量、稠度、颜色、气味、异物等方面进行评定精子。
1.1.2 显微镜。
（1）精子活率：直线向前运动精子百分率一般在0.7～0.8左右，不低于0.6。
（2）精子密度：A、估测法，粗略分为“密”“中”“稀”三级，但有赖于检查者经验有一定的主观性，误差较大。
B、血细胞计计数法，使用血细胞板，可准确的测定每单位容积精液中精子数。
1.2 冻精质量评定在某一天冷冻精液，要在冷冻当天和冷冻后第14天解冻检评。
抽检两次仍低于标准，整批冻精将被弃去。
冻精出售还要进行最后一次检评。
冻精活力按国际标准不得低于0.3，每份冻精有效精子数不得少于1200万。
另外，对顶体完整率和细菌指标都有严格的规定。
2 精液稀释和稀释度目前牛冷冻精液所用稀释液，有70%的国家使用20%卵黄一三基缓冲液；20%是牛奶卵黄稀释液；10%卵黄—乳糖液制作颗粒。
2.1 精液稀释目的1）扩大精液容量；2）通过降低精液能量消耗，补充适量营养和保护物质，延长精子的寿命；3）便于精子保存和运输.2.2 精液稀释液的主要成分及其作用2.2.1 稀释剂。
主要用来扩大精液容量。
因此，此种物质的剂量，必须与精液有相同的或相似渗透压。
《精液的冷冻保存》课件
冷冻保存的精液可以用于帮助亲属实现生育，提供了一种救命的选择。
冷冻保存的优势
保质期长
精液在低温环境下可以保存多 年，保持生育能力的质量。
高成功率
冷冻保存的精液在解冻后可以 仍然保持较高的受精能力，提 供了较高以根据需求 随时取用，方便灵活。
冷冻保存的步骤
《精液的冷冻保存》
精液的冷冻保存是一种先进的技术，可以帮助人们实现生殖自主。了解冷冻 保存的原理和方法对于对生育计划有影响的人群来说尤为重要。
冷冻保存的需求
1 生育自主权
冷冻保存提供了人们保留生育能力的方式，为其日后的生育计划提供了灵活性。
2 医学治疗
一些医学治疗方案可能对生育能力造成不可逆的损害，冷冻保存可以帮助人们在治疗前 保留生育的可能性。
结语
冷冻保存技术的发展为许多人提供了实现生育愿望的机会。了解冷冻保存的 优势和步骤，将有助于人们做出明智的生育决策。
生殖技术实验室
生殖技术实验室使用冷冻保存技 术作为其研究和治疗的基础。
冷冻保存的前景
科学进步
随着科学技术的不断发展，冷冻保存技术也将不断提高，为更多人带来福音。
社会认知
人们的生育观念正在逐渐改变，冷冻保存技术的认知度将逐渐提高。
政策支持
许多国家和地区已经意识到冷冻保存的重要性，将提供相关政策和支持。
1
检测评估
对精液进行检测和评估，确保其质量符合保存要求。
2
冷冻处理
采用特定的技术将精液在低温下快速冷冻，使其保持生育能力。
3
保存管理
将冷冻好的精液储存到特殊的冷冻设备中，并进行管理和跟踪。
冷冻保存的应用
生育诊所
冷冻保存的精液在生育诊所中应 用广泛，帮助人们实现他们的生 育目标。
精子的简易保存方法
精子的简易保存方法
精子的保存方法可以分为两种：长期保存和短期保存。
短期保存方法：
1. 使用特制的精子保存液：在实验室或生育技术中心，精子可以使用特制的精子保存液进行短期保存，如液氮冷冻保存液。
2. 阴囊内保存：男性可以将精液保存在阴囊内，阴囊的温度比体温低一些，有助于延缓精子的新陈代谢，但此方法只适用于短期保存，不能超过数小时。
长期保存方法：
1. 冷冻保存：精子可以被冷冻并存放在液氮罐中，通常使用特殊的冷冻保存液保护精子的质量。
这种方法能够长期保存精子，但需要專業的冷凍保存设备和技术。
2. 冷冻干燥保存：精子可以冷冻干燥并封装在密封容器中，以在较长时间内保持稳定。
这种方法也需要专业的设备和技术。
无论使用哪种方法，精子保存前需要经过初步的处理，如去除其他液体和不健康的精子，以保持保存的精子的质量和活力。
精子保存的有效期根据保存方法的不同可以从数小时到数十年不等，建议咨询专业的医生或生殖技术专家获得更详细的指导。
《精液的冷冻保存》课件
精液冷冻保存技术最早可追溯到20世纪50年 代，当时主要用于研究目的。
到了70年代，随着人工受孕技术的发展，精 液冷冻保存开始广泛应用于人类生殖领域。
如今，精液冷冻保存已经成为一种成熟的生 殖技术，为许多不孕不育家庭带来了希望。
精液冷冻保存的原理
01
精液在低温环境下会进入一种“ 玻璃化”状态，细胞代谢活动减 缓甚至停止，从而达到保存的目 的。
技术进步
随着科学技术的不断进步，精液冷冻保存技术有望得到进一步优化，提
高精子复苏率和保存效果。
02 03
广泛应用
随着人们对生殖健康和遗传资源保护的意识不断提高，精液冷冻保存的 应用范围有望进一步扩大。例如，用于生殖健康治疗、人类基因资源保 护等领域。
法规完善
随着精液冷冻保存技术的发展和应用范围的扩大，相关法规和政策也应 不断完善，以保障个人隐私和合法权益，同时防止技术滥用。
02
当需要使用时，精液经过复温后 ，精子可以恢复活力，进行人工 受孕。
02
精液冷冻保存的过程
精液的采集和处理
精液采集
通过手淫或性交的方式采集精液 ，确保精液新鲜、无污染。
精液处理
去除精液中的杂质和死精子，进 行精子的分离和筛选，以获得高 质量的精子样本。
精液的低温保护剂处理
低温保护剂的选择
选择适当的低温保护剂，以减少精子在冷冻过程中受到的损 伤。
伦理和社会问题
隐私权问题
精液冷冻保存涉及个人隐私，如何确保个人隐私不被侵犯是一个重要问题。应制定相关法规和政策，规范精液冷 冻保存的采集、存储和使用过程。
滥用风险
精液冷冻保存可能存在被滥用的风险，例如用于非法的生育目的或基因编辑。应建立严格的监管机制，防止滥用 行为的发生。
鸡精液冷冻技术操作规程
鸡精液冷冻技术规程1范围本文件规定了鸡精液冷冻的器具清洗与消毒，精液采集、稀释（I液）与质量检测，冷冻保护液（11液）添加与细管精液制作，细管冷冻，细管解冻及活力检测，离心去甘油（11I液、IV液），输精和冷冻精液受精率检测，细管冷冻精液的保存等内容。
本文件适用于长期超低温冷冻保存的鸡精液细管精液制作。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
牛冷冻精液包装、标签、储存和运输GB/T30396牛冷冻精液生产技术规程NY/T1234家禽精液品质检测方法NY/T40473术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
4器具清洗与消毒重复使用的器皿，使用后立即用清水浸泡，其它操作按NY/T1234的规定执行。
5精液采集、稀释（I液）与质量检测5.1提前2h将用到的稀释液，从冷冻室置入冷藏室。
5.2采用背腹部联合按摩双人或单人采精法，手握预热含有0.2mL左右第一步稀释液（简称“液”）的5mL离心管采集单只公鸡精液，轻轻混匀后，置于2°C~5°C冷藏箱中（可以用冰水混合物）。
依次采集完所有公鸡精液后，立即运输到实验室。
5.3将稀释后精液转移至2C~5°C冷藏箱，从第一步稀释后冷藏计时约30min。
同时取10μL精液在32℃视屏恒温显微镜下观察，活力≥0∙7（评定依据见附录C）,密度≥1.5χl0t7mL用于精液冷冻，眼观密度评定见附录C。
一般稀释比例为原精与稀释液1：1,如果密度太高则再利用等温I液进行适当稀释。
5.4如果远距离运输原精制作冻精，用I液等比稀释后存放于2C~5C冷藏箱，应在4h内进行冻精制作。
6冷冻保护液（11液）添加与细管精液制作6.1将已预冷或现配的第二步稀释液即冷冻保护液（简称“II”液），按精液与稀释液比例1：1（含甘油浓度为12%）或者1：0.5（含甘油浓度为18%）,加入到第一次稀释平衡后的精液中，甘油终浓度为6%,并在2C~5C条件下平衡IOmin。
精液冷冻技术
Wolley等人的研究显示，超微结构的变化是发 生在融化期间或融化之后
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6
精液冷冻的原理（四）
三、精液冷冻的基本原理
冷冻损伤是肯定的 在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率 使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率 实现起来非常困难 冷冻保护剂的出现是一大突破
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5.6
8.0
754
338
6.4
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影响精液冷冻质量的因素
关键因素：冷冻程序、冷冻保护剂 其他因素：
禁欲时间：３-５天 精液取出至冷冻时间：１小时之内 冷冻保护剂的添加方式：室温，缓慢添加 复温方式与时间：３７ ℃水浴１０分钟 精液分析的标准化
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精液冷冻技术的新进展 ---玻璃化冷冻（一）
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冷冻保护剂的种类与配制（二）
二、甘油-卵黄-枸橼酸钠型冷冻保护剂的配制
冷冻保护剂配方(总量=20ml)
CPM：SEMEN 甘油(ml) 卵黄(ml) 枸椽酸钠(mg) 葡萄糖(mg) 纯水(ml)
1：1
2.8
4.0 377
169
13.2
1：2
4.2
6.0 565
250
9.8
1：3
研究方向： 寻找容易实现玻璃化且对精子损伤小的保护剂
设法提高冷却速率
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玻璃化：液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程 优点：快速冷冻，不形成冰晶 实现玻璃化的途径：极大提高冷却速率、增加溶液浓度 技术上的难点：
很难达到实现玻璃化的高冷却速率 添加高浓度冷冻保护剂可降低玻璃化所需的冷却速率， 伴随对精子损害的增加
猪精液冷冻技术
猪精液冷冻技术广东畜牧兽医科技2010年(第35卷)第4期畜牧技术?21?猪精液冷冻技术李志鹏,陈兴宏,张静(广东宝兴农牧科技有限公司,广东兴宁514571)中图分类号:S814.3文献标识码:A文章编号:1005—8567(2010)04—0021—03 精液冷冻保存技术(Semenfreezing)是将精液特殊处理后,通过液氮(-196℃),干冰(-79℃)或其它冷源冷冻,超低温保存,使精液达到长期保存.精液冷冻保存技术的主要原理是精子在冷冻状态下,代谢几乎停止,生命保持相对静止状态,升温后又能复苏而不失去受精能力.精液冷冻保存技术解决了精液难以长期保存的问题,其优点为:①使精液不受时间,地域和种畜生命限制,便于开展省际,国际间运输和品种交流,极大地提高优良公畜利用率,加速品种育成和改良;②引进国外高性能公猪冻精取代引进活体公猪,可节省外汇支出;③对优良种畜在短期进行后裔测定,保留和恢复某一品种或个体优良遗传特性;④冷冻精液通过后裔测定或疾病检测,保障遗传进展的稳定和生物安全;⑤建立基因库,保护地方品种和珍稀濒危品种资源.因此具有重要的应用潜力和广阔的应用前景[].1猪精液冷冻保存技术研究简况Ivanov在1926—1927年首次尝试进行猪冷冻精液保存技术研究及冻精人工授精,之后,Milo—vanov等在1930—1936年进行同样试验,并最早成功地配制了猪精液冷冻的稀释液(葡萄糖一硫酸盐和葡萄糖～酒石酸盐).早期的猪精液冷冻试验结果表明,冷冻后的精液中,只有一部分精子能够存活,并且冷冻保存比液态保存对猪精子的损伤更严重,因为温度下降对猪精子质膜,超微结构和生化组成造成损伤.1949年,甘油对精子的抗冻保护作用被发现,推动了猪精液冷冻保存技术发展.1956 年,Polge[31首次报道成功得到冻精人工授精出生的仔猪.1975年,Pursel发明简便的猪精液冷冻和解冻方法,并在同年报道通过对23头青年母猪进行颗粒状冷冻精液解冻后人工授精,1l头于配种后48h后剖检,配种受胎率为45.45%,另外12头于配种后25～30d后剖检,配种受胎率为收稿日期:2010—03—1683.33%.但由于受胎率和产仔数都明显低于本交,直到2000年,全世界冻精的应用估计还不到猪人工授精总量的1%[5].从外国进口的冷冻精液大多用于扩大本国猪品种的遗传资源和进行杂交改良同. 虽然猪精液冷冻保存技术发展缓慢,但国内外有关专家始终在不懈探索.随着各种新的检测手段的建立,可检测到精子细胞质膜化学组成变化,通透性改变,表面基因的不同以及各种冷冻损伤,为分析各种因素的影响提供了更确凿的科学依据. 2002年,Thurston等m分析了质膜表面基因限制性片段多态性,发现其中16个片段对冷冻结果影响较大.从而可看出个体差异对冷冻效果的影响. 2006年,Ricker等[8]用傅氏转换红外光谱仪QIR)和扫描电镜(SE检测到在低温下质膜膜相的变化.由于膜相变化,引起了膜通透性改变,活力下降,信号通路改变,直至引起细胞死亡.Brouwer等[9]监测和定位了脂质过氧化物的代谢;Fraser等[10]用改良的中性彗星实验评价DNA的损伤.DNA 的完整对于自然受精和人工授精的受精率,胚胎的正常发育,胎儿和后代的生长至关重要.2猪精子冷冻特点和冷冻机理2.1猪精子冷冻特点猪的精液与其他哺乳动物存在较大差异,其精液量大,精子对冷休克特别敏感.影响精子质膜流动性和抗冷休克能力的因素包括:精子膜上胆固醇和磷脂的比例,烃链的饱和程度,蛋白质和磷脂的比例等[11].牛精子对冷休克不敏感而猪精子对冷休克敏感,主要原因:第一,精子膜上磷脂组分,主要调节膜流动性稳态的磷脂～磷脂酰胆碱在猪精子中的含量低于牛精子:第二,精子膜上胆固醇/磷脂及胆固醇分布,猪精子胆固醇/磷脂较低,胆固醇分布量外膜大于内膜.内膜对冷休克敏感,降温过程中,膜磷脂的侧移受到限制,使膜磷脂从液晶相转为凝胶相;同时,由于膜上磷脂相变温度不同,导致膜成份侧22?畜牧技术猪精液冷冻技术一李志鹏,等移和重排,膜表面脂质分离,蛋白质不可逆凝集;另外,精子膜状态的改变导致游离Caz+从细胞外流入细胞内,刺激依赖Caz的细胞提前获能(也称假成熟)『1.此外,受猪精子遗传特点影响,冻精的体外活力和解冻后受精等能力存在个体差异性.2.2猪精子冷冻机制冷冻过程是精细胞脱水过程,此过程中细胞受到化学性和物理性损伤:第一,化学性损伤:冷冻过程中细胞外溶液形成部分冰晶,使未结冰部分形成高渗溶液,精子内水分向外渗透,导致精子脱水,淹渍而失去活力;第二,物理性损伤:冰晶对细胞膜及细胞内部结构产生机械性损伤,导致细胞死亡.冷冻过程中,细胞内形成的冰晶的大小和数量影响细胞受损伤程度,微晶状态的冰晶不会损伤细胞,而对精细胞造成物理性损伤的大冰晶会导致细胞损伤或死亡『1.3影响猪冷冻精液因素3.1稀释液和冷冻保护剂在温度变化过程中,精液对精子的保护能力是有限的.为此,进行精液冷冻保存时要配合稀释液.稀释液是精子的营养剂和保护剂,通常由能量物质(糖类),低温保护剂(蛋白质,脂蛋白等),防冻保护剂(甘油,二甲基亚砜等),添加剂(十二烷基硫酸酯等),维持渗透压物质(柠檬酸钠,Tris等)和抗菌素(青霉素,链霉素等)组成.(1)糖类和缓冲物质:稀释液中使用的糖类主要有葡萄糖,果糖,乳糖.胡健宏等n4发现,在传统Tris一柠檬酸一葡萄糖稀释液基础上添加25%海藻糖,能显着(P<O.05)改善和提高猪精液的冷冻效果,解冻后猪精子活力,活率,线粒体活性,质膜以及顶体完整性分别提高41.38%,46.34%,44.56%,43.51%和64.09%.(2)卵黄:卵黄中保护精予的有效成分是低密度脂蛋白(LDL).保护作用机制存在三组假说.一种假说认为LDL与精子膜结合通过稳定膜而起保护作用.另一种假说认为LDL中的磷脂通过在精子表面形成一层保护膜或者替换在冷冻过程中丢失的膜磷脂保护精子.第三种假想是LDL与精浆中的有害阳离子肽类竞争结合精子膜而发挥保护作用[15].(3)甘油:是精液冷冻过程中最重要和最常用的冷冻保护剂,冷冻过程中,精细胞主要受到冰晶的物理和化学损伤使精细胞处于脱水状态,导致细胞死亡,甘油的理化特性使其能减少冰晶对细胞的损伤.但甘油对精子有毒害作用,所以甘油添加浓度,添加温度和平衡时间直接影响猪精子冷冻后的存活率.2006年,姜兴刚等[1圈研究表明添加2%和4%甘油对猪精子冷冻保护作用显着(P<0.05) 高于添加6%和8%甘油组.1996年,Fiser等?刀对保存在0.5mL细管中的猪精液用不同甘油浓度(0～6%)和不同平衡时间进行研究,结果表明:在5℃下平衡4h后进行冷冻,解冻后精子活率和活动精子的顶体完整率最高.(4)其他添加物质:为了提高猪精液的冷冻效果,研究者尝试在稀释液中添加各类物质以改善精子外环境的理化特性,提高冻精解冻后受精率.常用的添加物有十二烷基硫酸酯及其类似物,2一羟脯氨酰一一环化糊精,透明质酸,N一乙酰基-D-葡糖胺,a一维生素等.李青旺等踟在猪精液冷冻稀释液中添加400mg/L安钠咖,精子冻后活率和生存指数显着高于对照和添加VC两组(P<O.01). 3-2精液平衡2006年,姜兴刚等[16]研究表明平衡时间为60min和90min时,精子活力显着[1高于平衡时间为0,30min和120min组,且60min组精子活力最高.3.3冷冻目前,猪精液冷冻的方法基本有两种,即Beltsville和Westendorf法.前者是将富含精子的部分采集后与精清持留2h,然后离心, 降温3h后在干冰上制成0.15～0.20mL的颗粒冻精;后者是将精液按1:2稀释,然后在稀释液中降温,最后制备成细管冻精.后来研究者根据研究结果对细管冻精进行了改进,如2mL细管冻精,5 mL塑料袋和5mL大管等剂型.Fiser等n1996年对猪精液的研究中表明甘油浓度和冷冻速度之间的相互影响非常重要.他们对冷冻速度从1℃/min到1500℃/min的范围对猪精子存活曲线进行了研究,发现降低甘油浓度可获得较好的冷冻速度.有效的冷冻需达到三个因素的最佳组合:甘油浓度,冷冻速率和解冻速率,而这三个因素都与冷冻分装的细管型号有关. 1995,PurselV等[1町研究表明,不同剂型最佳组合分别为:0.25mL细管采用50℃/min,1.5%甘油浓度;0.5mL细管采用3O℃/min,3%甘油浓度;5 mL大型细管采用16℃/min,3.3%甘油浓度.3.4解冻解冻操作程序与冷冻过程是相对应的,解冻效果受冷冻速率影响.理论上讲,快冻应该快融,其程度视不同类型细胞而略有差异.精子的冷冻损伤主要是因冷冻过程中未达到最佳冷冻猪精液冷冻技术一李志鹏,等畜牧技术?23?速率引起.以最佳冷冻速率冷冻精子,而后提高解冻速率可增加解冻后精子活率和顶体完整率.C6rdova—Izquierdo等[删研究5mL细管冷冻猪精液,两种不同解冻温度42℃,50℃经40s解冻后的精子质量.结果表明,42"C解冻后精子活率显着(P<O.05)低于50℃,二者的顶体完整率,穿卵率,单精入卵率和多精入卵率相似.3.5冷冻剂型在猪精液冷冻保存研究中,分装型号有:颗粒,5mL大型细管,5IIlL平管或平胶袋,4-5mL铝袋等.Wongtawan等]将猪精液分别用0.5mL细管,2.8mL多聚平管(4个0.7mL平管组成)冷冻猪精液,解冻后精子活力分别为0.428,0.443.5mL细管,平管和塑料袋冻精含有1头份精子数量,可减少精液分装和解冻时间,使输精操作更简便,省时,因此,值得更深入研究.3.6保存猪冷冻精液的保存必须使其全部浸入液氮中,使用过程中为了缩短冷冻精液离开液氮时间,将液氮罐放在距离解冻设备或水浴锅最近的位置.冷冻精液暴露于空气中超过5s导致精液品质下降,因此,整个过程控制在5s内.4发展前景随着分子生物学,细胞生物学及低温生物学的不断渗透与结合,猪冷冻精液保存技术将日趋成熟,生产实践中,提高优良公猪利用率,减少疾病传播,保护地方优良品种和珍稀濒危品种资源,加快育种进程,提高母猪受胎率和增加产仔数等方面具有重要意义,因此具有重要的研究价值和广阔的市场前景.参考文献:[1]周佳勃,岳奎忠,孙兴参,等.猪精液冷冻技术的研究进展[J].中国兽医,2002,22(3):295-299.[2]禚艳书,王坚,刘铁铮.猪精液冷冻保存研究进展[J].江苏农业科学,2006,(3):136-140.[3]PolgeC.Artificialinseminationinpigs[J].V etPec,1956,68:62—76.【4]PurselVG.JohnsonLA.Freezingofboarspermatozoa: Ferti1izingcapacitywithc0ncentratedsemenanda newthawingProcedure[J].JAnimalSci,1975,40,99-102. 【5]ThibierM.WagnerHG.Worldstatisticsforartifi—cialinseminationincattle[C].Proc14thIntCongr AnimReprod,2000,22:76.[6]SoedeNM.Oestrusexpressionandtimingofovulati—oninpigs[J].BritishPigScience,1998.39:187—194. [7]ThurstonLM,SigginsK,MilehamAJ,eta1.Identifi—catioonofamplifledrestrictionfragmentlength polymorphismmarkers1inkedtogenescontrol1ing boarspermviabilityfollowingcryopreservation[J] BiolReprod,2002,66:545—554.[8]RickerJV,LinforJJ,DelfinoWJ,eta1.Bal1.Equine SpermMembranePhaseBehavior:TheEffectsofLiPid—Based[J].CryoproBioReprod,2006,74:359—365. [9]BrouwersJF,SilvaPFN,GadellaBM.Newassaysfor detectionandlocationofendogenous1ipidperoxi—dationproductsinlivingboarspermafterBTSdi—lutionorafterfreeze—thawing[J].Theriogeno10gy, 2005,63:458—469.[10]FraserL,StrzezekJ.Effectofdifferentprocedures ofejaculatecollection,extendersandpackageson DNAintegrityofboarspermazotoafollowingfreez—ing—thawing[J].AnimReprodSci,2007,99:317—329.[11]BreiningerE,BeorleguiNB,Flahertv0CM.Alpha—tocopherolimprovesbiochemicalanddynamicparam etersincryopreservedboarsemen[J].Theriogenolo—gy.2005,63(8):2126—2135.[12]DeLeeuwFE,ColenbranderB,V erkleiJAJ.Therolemembranedamageplaysincoldshockandfreezinginjury[J].ReprodDomestAnim,1990.1(Supp1):95—104. [13]YiYJ,ctose—eggyolkdilurersupple—mentedwithN—.acetyl——D—.glucosamineaffectacrosome morphologyandmoti1ityoffrozen—thawedboarsperm].AnimalReproductionScience,2002,74(3/4):187-19~[14]胡建宏,李青旺,江中良等.海藻糖对猪精液冷冻保存效果的影响[J].畜牧兽医,2006,37(12):1297-1303.[15]赵连真,李孝娟.卵黄对精子保护作用的机制[J].黑龙江动物繁殖,2006,14(4):23.[16]姜兴刚,赵桂英,绍禹等.冷冻前离心方法,平衡时间,甘油浓度对猪精子冷冻保存的影响[J].黑龙江畜牧兽医, 2008,6:42—43[17]FiserPS,binedeffectofglycerolc0ncentrati0nandcoolingvelocityonmotilityand acrosomalintegrityofboarspermatozoafrozenin0.5mLstraws[J].MolecularReproductionDevelop～ment,1996.25:123—129.[18]李青旺,江中良,王立强,等.猪精液冷冻保存的初步研究[J]. 西北农林科技大学(自然科学版),2003,31(4):63—66.[19]PurselVG.ParkCS.Freezingandthawingproce—dure~forboarspermatozoa[J].SwedishUniversity AgriculturalSciences,Uppsala,1995.147—166.[2O]C6rdova—IzquierdoA,O1ivaJH.Lle6B.Effectof differentthawingtemperaturesontheviability,invitroferti1izingcapacityandchromatincon—densationoffrozenboarsemenpackagedin5mLstraws[J].AnimReprodSci,2006,92(1-2):145—154.[21]TuempongWongtawan.FernandoSaravia,MargaretaWal—lgren.Ferti1ityafterdeepintra—uterineartificial inseminationofc0ncentratedlow—volumeboarsemen doses[J].Theri0geno1ogy,2006,65(4):773-787.。
精子的简易保存方法
精子的简易保存方法精子的保存方法主要是为了保持其活力和生存能力，以便在需要的时候进行使用。
以下是几种可以较为简便地保存精子的方法：1. 冷冻保存法：将精液收集到无菌容器中，并添加适量的冷冻保护液，如冷冻培养基、人工输精管液等。
然后，经过预冷处理，将容器放入液氮罐中迅速冷冻至-196，即可长期保存。
这种方法适用于较长时间保存，保存时间可达数年。
2. 低温保存法：将精液收集到无菌容器中后，使用高冷冻度冰箱或液氮冷冻保存。
一般来说，温度介于-20到-80之间，可以保存数月至数年不同程度。
这种方法适合于中长期保存，同时比冷冻保存法更便捷。
3. 保护剂保存法：使用专门的保护剂可以保持精子的活力和生存能力。
常用的保护剂有乳糜、蔗糖、麦角酸等，可以有效地减少精子受损和死亡。
将精液和保护剂混合后，放置在恰当的温度下保存。
这种方法适用于短期保存，保存时间一般为几天至一周。
4. 冷冻干燥保存法：将精液在无菌条件下进行冷冻干燥处理，即将冷冻的精液转变成固态，然后经过低温真空下的脱水处理。
这种保存方法可以延长精子的存活时间和保存时间，适用于长期保存。
5. 混合保存法：将精液与其他物质（如胎牛血清、羊血清等）混合，以提高其保存能力。
这种方法被广泛应用于精子库的建立和管理，可以有效地保存大量的精子样本。
值得注意的是，以上方法仅仅是保持精子保存的基本方法，实际操作中还需结合具体情况和实验室设备来进行选择。
此外，保存过程中需要保持无菌条件、避免温度变化过大和震荡等，以确保精子的质量和保存效果。
总结起来，精子的保存方法多种多样，从冷冻保存到保护剂保存再到混合保存等不同方式，都可以较为简便地保存精子，以备需要时使用。
选择何种保存方法应根据实际情况来定，同时在保存过程中要注意维持适宜的温度和无菌环境，以确保保存质量和效果。
稀少精子冷冻进展
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202X
稀少精子 冷冻进展
现状
01
有60% ~75%的男性不 育患者表现为少精子症、 弱精子症、无精子症等精 子质量异常。其中梗阻性 无精子症和隐匿精子症患 者通常不易获得精子,只 有通过手术或者偶尔处于 治疗情况较好的状态时才 有少量活动精子,因此这 种来之不易的精子就迫切 成为要求被储备的对象, 若能储存成功将避免再次 手术或者取卵日无精子可 用的风险。
02
目前,对于这种类型的精 子冷冻复苏效果差 ,解冻 回收率为59% ~100%, 而存活率在8% ~85% 。 尚无公认的有效冷冻方 法,对于胚胎学家来说是 严峻的挑战。
精子冷冻损 伤的机制
氧化应激损伤 精子结构的改变 精子功能的损伤
稀少精子冷冻载体
空透明带 冷冻法
空胶囊冷 冻法
冷冻环冷 冻法
冷冻薄膜 或薄片冷 冻法
精子冷冻方法
A
程序冷 冻法
B
玻璃化 冷冻法
C
熏蒸 法
影响稀少精子冷冻的其他因素
有较多研究从冷冻保 护剂的类型、添加与 否等方面进行探讨,结 果显示无冷冻保护剂 添加一样可以达到良 好的冷冻效果 。
01
还有研究从降温速率方 面观察冷冻精子的效果, 结果显示一步熏蒸法的 降温速率有更好的精子 复苏率。也有学者从冷 冻精子浓度控制、微滴 大小等多个方向阐述稀 少精子冷冻细节 。
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稀少精子冷冻技术
薛松果
临床应用价值高：
男方因素约占不孕症病因的30-40％，无精症约占男方因素的10％左右。
1992年Palermo等首先将卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术应用于临床，解决了男性严重少、弱、畸形精子症患者不能生育子代的难题。
而ICSI技术结合显微外科取精术如附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA)、经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和睾丸精子抽取术(testicular sperm extraction，TESE)则使无精症患者养育遗传学子代成为可能。
然而，MESA、PESA和TESE等都是创伤性手术，多次反复手术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，在女方采卵当日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。
技术难度大：
但是，传统的精子冷冻采用 1.8mL的冷冻管(Cryovial)或0.25－0.5mL麦管(Straw)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程还需要对精子作2-3次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。
而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。
现状：
自Jacques Cohen等报道用空透明带作为载体进行人单个精子冷冻以来，有多个载体被报道可用于单个或稀少精子的冷冻保存，如ICSI注射针、冷冻环（Cryoloop）、Cryotop、Cell Sleeper等等。
但截至目前，尚没有一个理想的、简单、高效的方法和载体用于人辅助生殖临床上对无精症患者穿刺获得的精子进行冷冻保存。
九院特色：
自2010年开始，九院就尝试用自制的冷冻片Strawtop冷冻睾丸/附睾穿刺精子，并先后申请了两项稀少精子冷冻（含单个精子）方面的专利，我们的经验是，一个好的、适合在临床上推广使用的（不仅仅是研究用）稀少和单个精子冷冻的技术，应该满足三个条件：1 回收率高，这是前提，没有高回收率则会导致复苏后精子数量不足，而取消ICSI治疗周期，或被迫做卵子冷冻（该技术目前并不成熟，冷冻卵子的使用效率仅为新鲜卵子的50-60%）。
2 复苏存活率高，这是关键，要尽可能提高稀少和单个精子复苏后的存活率。
3 易于使用、可及性强，临床技术人员是否愿意使用对一个技术方法的推广至关重要。
九院已有成绩：
2009年3月18日-2015年12月31日
558人次，2960支，5.3支/人/次
附睾穿刺93人次，睾丸穿刺316人次，睾丸切开47人次，精液102人次。
九院方法：
九院用自制冷冻片Strawtop对穿刺获得的稀少精子进行冷冻保存，与传统的麦管法相比，二者复苏精子的受精率、优质胚胎率、临床妊娠结局等均无差异，但该方法可以大大降低无精子患者反复穿刺的发生率，在诊断性穿刺手术日对穿刺获得的精子进行冷冻保存，极大避免取卵日无精子可用的情况发生。
该方法在本科室已经成功应用了5年。
冷冻
解冻：
匡延平，彭秋平。
精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置。
申请号：200810042695.4，主分类号 C12N5/08(2006.01)I，分类号：C12N5/08(2006.01)I C12M3/00(2006.01)I，公开号：101671651，公开日：2010-03-17
薛松果，彭秋平，曹少峰，匡延平。
一种微量精子冷冻保存载体。
申请号或专利号：201520322730.3
Songguo Xue, Qiuping Peng, Shaofeng Cao, Qiao Y u, Jiqiang Si, Yanping Kuang*, Cryopreservation of a small number of human spermatozoa with home-made Strawtop: 3 years experience, The 2nd World Congress on Fertility Preservation, Miami USA, 2011.12.08-10, Journal of assisted reproduction and genetics, 28, 991-992.
Qiu-Ping Peng, Shao-Feng Cao, Qi-Feng Lyu, Song-Guo Xue*, Wei Jin, Xiao-Yin Liu,Wen-Jie Zhang, H. Ingolf Nielsen, Yan-Ping Kuang, A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa, In Vitro Cellular & Developmental Biology –Animal, 47(8), 565-72, 2011。