环境工程微生物学大实验实验报告

环境工程微生物学大实验实验报告
实验十二环境中四环素抗性细菌的分离鉴定
组员：吴富华，张真，，金炯震
环5205
一、实验目的
1、自行设计实验方案从环境中分离四环素抗性菌的实验方法。

2、分离获得四环素抗行菌。

3、检测并分析获得的菌株的四环素抗性强弱。

4、学会通过16SrDNA鉴定实验获得的菌株的种属。

二、实验要求
1、自行设计实验证明富集培养是否成功。

2、观察并记录实验现象，作适当的分析或解释。

3、获得至少一株四环素抗性菌（不要多于三株），并进行短期保存。

4、根据实验视频指导和说明，完成菌株基因组DNA纯化，16SrDNA的PCR扩增。

5、比较各组筛选出的抗性菌抗性强弱。

6、各组间交流实验过程和实验结果，分析抗性菌抗性的影响因素。

7、养成良好的实验习惯和团队合作的作风，并给出评价。

三、实验器材
1、培养基（营养琼脂，琼脂粉，酵母膏，胰蛋白胨，氯化钠），提供四环素，琼脂糖，灭菌条件。

2、室温和37℃恒温培养箱和摇床。

3、离心机，漩涡震荡仪，PCR仪，电泳仪，紫外成像分析仪。

四、实验步骤（略）
1、配置富集培养基和四环素梯度培养基
2、四环素抗性菌富集培养
3、单菌株筛选
4、四环素抗性强弱比较
5、单菌株基因组DNA的提取
6、16SrDNA的PCR扩增
7、PCR产物电泳
实验内容、具体操作
单菌株基因组DNA提取（5.17进行步骤1-4；5.18进行步骤5-10；5.20进行步骤11）（1）选择5.8号挑选的菌株进行DNA提取实验；
（2）取200μL菌液转移到1.5mL灭过菌的EP管中，10000rpm常温离心1min，去掉上清（得到菌细胞）。

菌细胞可在-20℃冻存。

（3）如果是革兰氏阳性菌，取100μL，1mg/mL的溶菌酶/TE加到菌液中，漩涡震荡混匀，37℃温浴1h（溶菌步骤）。

（4）用取液器（移液枪）缓慢吸加500μL（革兰氏阳性）或600μL（革兰氏阴性）裂解缓冲液和20μL，20mg/mL蛋白酶K（proteinase K），充分混匀，50℃过夜（完全裂解细菌并降解所有蛋白质）。

（5）第二天，使用1mL一次注射器对溶液进行快速反复吹吸，一般操作十次以上（打断基因组DNA）。

（6）用取液器（移液枪）缓慢吸取600μL中性酚氯仿（pH6~8），振荡混匀，13000rpm离心5min（变性剩余蛋白质，并沉淀）。

（7）用取液器（移液枪）缓慢吸取400μL上层清液加入新管中，用取液器缓慢吸加异丙醇500μL，充分混匀，离心13000rpm，5min，弃上清（沉淀DNA）。

（8）用取液器（移液枪）缓慢吸加600μL，70%乙醇，颠倒混匀两次，离心13000rpm，0.5min，弃上清（先沉淀）。

（9）离心13000rpm，0.5min，用微量取液器吸走剩余上清（加速沉淀干燥）。

（10）开盖在室温下放置5~10分钟，使沉淀干燥。

假如50μL无菌去离子水（干燥溶解DNA）。

DNA可以保存在-20℃冰箱。

（11）使用NanoDrop仪器测定DNA浓度。

3、16SrDNA的PCR扩增（5.22完成）
（1）配置PCR反应母液：10×反应缓冲液5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，无菌去离子水33.5μL，Taq酶0.5μL（使用取液器，枪头触碰液面吸取）。

混匀。

（2）取100~500ng基因组DNA，无菌去离子水稀释至5μL，加入反应母液并混匀。

（3）PCR扩增，反应程序如下设置：①95℃2min，②98℃10s，③55℃30s，④72℃1.5min，⑤回到②，35个循环，⑥52℃，5min，⑦4℃维持。

PCR产物电泳（5.22完成）
（1）0.8%琼脂糖凝胶的配制：在500mL锥形瓶中加入1×TAE工作液100mL（从50×TAE 即50倍浓缩的TAE储液来稀释获得），加入0.8克琼脂糖，微波炉加热至沸腾，立即取出（注意防烫伤），混匀观察是否完全溶解。

一般反复三次即可全部溶解。

加入10μL Gel-Red，轻轻摇匀后倒入事先插好小孔梳子制胶版中。

置于通风橱中凝固30分钟。

（2）取出PCR产物，每50μL体积加入6μL的10×上样缓冲液（10×loading buffer）,混匀。

将制好的胶轻轻拔去梳子，放在电泳槽中，有空的一边朝向负极。

加入1×TAE使得缓冲液正好没过凝胶，胶孔中无气泡。

在每个胶孔中加10μL样品，最后在边上孔加10μLDNA 分子量标准（DNA marker）和阳性对照（助教预实验获得）。

设定电压为120V，等蓝色电泳带跑至一半胶长度后（一般20~30min），停止电泳。

（3）将电泳后的胶放在紫外成像仪上，拍照，确定目标DNA条带。

六、实验结果记录与讨论
1、抗性比较平板划线结果图：（结果展示顺序为四环素浓度从16mg/L~256mg/L，我组1024mg/L、512mg/L平板未长出菌落，方位为每个图片上部标有w5部分）
①②
③④
⑤
分析：如图可看到，菌落生长情况为，随着浓度不断升高，菌落逐渐稀疏，可能因为四环素浓度越高对细菌的生长抑制效果越明显，16mg/L~256mg/L的培养皿上都长出了菌落，说明抗性菌分离成功。

2、DNA浓度测定结果（上）以及抗性菌镜检结果（下）（提取的DNA以及镜检对象为抗性为256mg/L的抗性菌（阳性））
①②
③
分析：如②图所示，我组所得DNA浓度为121.2ng/μL，浓度偏低，但结合其他组所测数据，存在有些组跟我们所测的数据相差无几，说明并不是偶然，在操作上没有什么疏漏。

3、PCR电泳结果图：
分析：上图为DNA凝胶电泳结果，DNA marker 在最左边，从上到下依次为6000bp, 4000bp, 3000bp,2500bp, 2000bp, 1500bp, 可见获得的目标片段在4000bp到3000bp之间并且成像较宽较亮，则此片段的DNA含量较高，分子量较为分散，在1500bp处有较弱成像，可能为分子量较小的引物。

所用的引物为8F, 1492R。

由配制的培养皿至长菌的过程图：
七、思考题
（1）如果筛选到的菌株为革兰氏阴性菌，用革兰氏阳性菌的方法提基因组DNA，能成功吗？为什么？
答：可以，因为提取革兰氏阴性菌DNA 的方法只比阳性菌少了一个溶菌的步骤。

其中加入的100μL 1mg/ml 溶菌酶/TE 可以破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4 糖苷键，并使细胞壁破裂。

阴性菌细胞壁，比阳性菌的细胞壁更易破裂，增加溶菌步骤应该更好成功。

（2）提基因组DNA步骤（5）中变性剩余蛋白，这些蛋白主要是什么蛋白？
答：主要是步骤（3）所加的蛋白酶K。

（3）比较其他组和自己组实验方案和实验结果的异同，从实验方案角度解释本组筛选到的菌株抗性强或者弱的原因。

答：我组筛选出来的细菌菌四环素抗性比其他的组的要低一些，主要原因可能是活性污泥中不同抗性的抗性菌分布存在差异，在取活性污泥样品时没有取到抗性较大的菌。

也可能因为培养时间较短，抗性较高的细菌浓度较小，细菌没有在较高浓度浓度下明显生长成可观测到的程度。

因此未筛选到。

八、组内分工情况
1、4.24—4.28的菌株培养与筛选：张真主要负责平板划线，吴富华负责梯度浓度培养基的配制，和金炯震负责镜检；
2、5.8抗性强弱比较，吴富华、和金炯震镜检，张真平板划线；
3、DNA提取、PCR扩增以及PCR产物电泳由全组人员共同合作完成。

九、实验总结
实验结果是我们组获得了最高有256mg/L四环素抗性菌，如果但从组内的平行实验组及浓度梯度组的结果作比，是没有大问题的，实验中的步骤也都很好的完成，但是在组间对比中，我们组的菌的抗性要弱于他们的。

造成这个结果的可能有很多，比如前面说到的菌源中本就没有更高的抗性菌落，或者抗性菌生长缓慢，短期培养未见可见菌落等，再来就是如筛选培养基出现差错，四环素不足等原因，致使组内实验结果不错，但是组间比对较差。

虽然实验的结果并不如我们预计的那么好，但是实验操作本身没有错误，并且在实验过程中，引发了很多我们关于如何实验，如何筛选等的深入思考，可以说是即学习到了知识，又增长了见识，建议以后的课程也多设置些大实验的项目。