抗原抗体反应及应用
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2011春夏
信阳农业高等专科学校生物技术系
抗血清的鉴定
效价鉴定： ➢ 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特 异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在 一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释 度。
亲和力鉴定： ➢ 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合 的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常 用亲和常数K表示。
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动物的选择
抗原与免疫动物的种属差异越远越好。 对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊
和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用 豚鼠。 抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量 血清（一头成年马反复采血百度文库获得10000ml以 上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家 兔或豚鼠即可。
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单抗制备的原理
MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对 一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。
为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和 Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本 原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与 能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合， 筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤 细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单 抗生产。
抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）
健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时 免疫3~4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同， 因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得 高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。 末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞 悬液。
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骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的 Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核 苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK） 缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合时应选择处于 对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应 大于95％）。
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动物采血法
颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山 羊等动物皆可采用。
心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动 物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动 物急性死亡。
静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可 用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集 多量血液。
抗体特异性鉴定： ➢ 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。
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7.1.2 单克隆抗体的制备
单克隆抗体（monoclonal antibody， MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一种 组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。 ➢ 单抗制备的原理 ➢ 单抗制备的材料 ➢ 单抗制备的技术 ➢ 单抗制备流程图
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免疫剂量与周期
免疫剂量： ➢ 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动 物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/ 只，小动物约0.1~0.6mg/只。
免疫周期： ➢ 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫， 一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物 10～14天，大动物2月左右。
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抗血清的纯化与保存
试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静 脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达 到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待 血凝后用针筒或吸管吸取血清。
抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、 亲和层析)。
保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠 NaN3或BSA）4℃保存。
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单抗制备的材料
骨髓瘤细胞： ➢ 不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌 ➢ 次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和 胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型
B细胞——小鼠或大鼠脾脏 融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲 HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和
第七章 抗原抗体 反应及应用
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本章提要
抗体的制备与应用 ➢抗血清的制备 ➢单克隆抗体的制备 ➢基因工程抗体 ➢催化性抗体 ➢单抗的医学应用
抗原抗体反应 ➢抗原抗体反应原理 ➢抗原抗体反应特点
常见免疫分析方法 ➢ 沉淀反应 ➢ 凝集反应 ➢ 免疫标记技术 ➢ 补体参与的抗原抗 体反应 ➢ 免疫分析灵敏度
本章小结
课后思考题
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7.1.1 抗血清的制备
抗原的准备 免疫动物
➢ 动物的选择 ➢ 免疫途径 ➢ 免疫剂量与周期 ➢ 动物采血法 抗血清的纯化与保存 抗血清的鉴定
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抗血清与多克隆抗体
抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动 物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。
HAT的RPMI1640）
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单抗制备的技术
抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 HAT法筛选杂交瘤细胞 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 单克隆抗体的制备与纯化
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抗原提纯与动物免疫
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免疫途径
一般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两 侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好； 亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 ➢ 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何 抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； ➢ 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬 液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。
多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清 中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产生的 抗体，所以称为多克隆抗体。
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抗原的准备
半抗原与载体偶联制备完全抗原
➢ 常用的连接反应及双功能连接剂
佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化
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抗血清的鉴定
效价鉴定： ➢ 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特 异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在 一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释 度。
亲和力鉴定： ➢ 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合 的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常 用亲和常数K表示。
信阳农业高等专科学校生物技术系
动物的选择
抗原与免疫动物的种属差异越远越好。 对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊
和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用 豚鼠。 抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量 血清（一头成年马反复采血百度文库获得10000ml以 上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家 兔或豚鼠即可。
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单抗制备的原理
MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对 一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。
为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和 Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本 原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与 能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合， 筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤 细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单 抗生产。
抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）
健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时 免疫3~4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同， 因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得 高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。 末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞 悬液。
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骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的 Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核 苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK） 缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合时应选择处于 对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应 大于95％）。
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动物采血法
颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山 羊等动物皆可采用。
心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动 物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动 物急性死亡。
静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可 用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集 多量血液。
抗体特异性鉴定： ➢ 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。
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7.1.2 单克隆抗体的制备
单克隆抗体（monoclonal antibody， MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一种 组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。 ➢ 单抗制备的原理 ➢ 单抗制备的材料 ➢ 单抗制备的技术 ➢ 单抗制备流程图
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免疫剂量与周期
免疫剂量： ➢ 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动 物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/ 只，小动物约0.1~0.6mg/只。
免疫周期： ➢ 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫， 一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物 10～14天，大动物2月左右。
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抗血清的纯化与保存
试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静 脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达 到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待 血凝后用针筒或吸管吸取血清。
抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、 亲和层析)。
保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠 NaN3或BSA）4℃保存。
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单抗制备的材料
骨髓瘤细胞： ➢ 不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌 ➢ 次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和 胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型
B细胞——小鼠或大鼠脾脏 融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲 HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和
第七章 抗原抗体 反应及应用
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本章提要
抗体的制备与应用 ➢抗血清的制备 ➢单克隆抗体的制备 ➢基因工程抗体 ➢催化性抗体 ➢单抗的医学应用
抗原抗体反应 ➢抗原抗体反应原理 ➢抗原抗体反应特点
常见免疫分析方法 ➢ 沉淀反应 ➢ 凝集反应 ➢ 免疫标记技术 ➢ 补体参与的抗原抗 体反应 ➢ 免疫分析灵敏度
本章小结
课后思考题
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7.1.1 抗血清的制备
抗原的准备 免疫动物
➢ 动物的选择 ➢ 免疫途径 ➢ 免疫剂量与周期 ➢ 动物采血法 抗血清的纯化与保存 抗血清的鉴定
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抗血清与多克隆抗体
抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动 物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。
HAT的RPMI1640）
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单抗制备的技术
抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 HAT法筛选杂交瘤细胞 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 单克隆抗体的制备与纯化
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抗原提纯与动物免疫
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免疫途径
一般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两 侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好； 亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 ➢ 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何 抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； ➢ 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬 液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。
多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清 中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产生的 抗体，所以称为多克隆抗体。
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信阳农业高等专科学校生物技术系
抗原的准备
半抗原与载体偶联制备完全抗原
➢ 常用的连接反应及双功能连接剂
佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化
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