疾病关键基因研究方法

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少量的蛋白表达还是能产生功能 敲除后功能失去
Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7.
什么情况下可以使用慢病毒CRISPR/CAS9技术: 花点钱再增加一下文章档次?
RNAi证明:
CRISPR/CAS9验证:
Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):652-65. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.016. Epub 2014 May 1. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia
瓶颈或核心不是基因操作技术 而是找到那个基因
芯片下游的工作
~30000个 基因 表达谱芯片 数百~数千个表 达差异个基因 简单数据分析 数十到数百个 基因 常规生物 信息学分 析Go & Pathway 等其他大 部分芯片 服务公司 能提供的 服务 找不到新基因, 更找不到新功 能基因
个性化的 生物信息 学与文献 分析
功能基因 (10%)
功能学验证
20~30个基因
机制研究方法
A-B-C-D 我们已经找到好的A 机制研究就是去寻找B 如何是个好的B? 如何寻找?
机制研究三大类: 1,分子相关性
上下游信号通路检测。A基因改变后,下游信号通路B如何改变。 (巨人的肩膀)
近年获得资助国自然基金列表选取
项目名称 依托单位 批准金 额 65 70 18 18 43 内质网应激条件下CHOP直接调节p53基因的转录来抑制结肠肿瘤生 复旦大学 长的机制研究 SNAREs介导膜运输障碍与BMPRⅡ关系及其在肺动脉高压发病中的 中国医学科学院阜 作用 外心血管病医院 11β-HSD1通过调节RAS通路介导糖尿病心肌病的作用和机制研究 miR-98通过调控动脉内皮LOX-1表达抑制动脉粥样硬化形成的研究 温州医科大学 安徽医科大学
相对“新”的基因更能出好的成果
A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能 文献实例
基因A 肿瘤C/临床相关性
前列腺癌 针对病人样 本(342例) 的预后生存 期判断。 _
功能D/实验方法
-
通路B
杂志名
Diagnostic Pathology 2 012, 7:127 BBCR (2013)
IF
-
_
典型SCI文章精要分析
Circ Res. 2015 Sep 2. pii: CIRCRESAHA.115.306624. [Epub ahead of print] miR-206 Mediates YAP Induced Cardiac Hypertrophy and Survival.
Int J Cardiol. 2015 Jul 2;201:38-48. doi: 10.1016/j.ijcard.2015.06.163. miRNA-204 drives cardiomyocyte proliferation via targeting Jarid2.
MicroRNA-214介导的Pim-1蛋白表达抑制通路在心肌肥厚中的作用及 浙江大学 其机制研究
Kindlin-2调控Ras/ERK信号促进肾成纤维细胞的增殖与活化及肾纤维 北京大学 化的机制研究 LNK基因影响JAK-STAT信号通路导致骨髓增殖性肿瘤发生的机理 北京大学
23
70 23 23
Cdlk1基因在非小细胞肺癌中异常高表达及其通过Notch信号通路促进 中国医学科学院肿 肿瘤转移的分子机制研究 瘤医院 HCRP1负调控EGFR在乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药逆转中的作用及 山东大学 机制
MicroRNA-214介导的Pim-1蛋白表达抑制通路在心肌肥厚中的作用及 浙江大学 其机制研究
Kindlin-2调控Ras/ERK信号促进肾成纤维细胞的增殖与活化及肾纤维 北京大学 化的机制研究 LNK基因影响JAK-STAT信号通路导致骨髓增殖性肿瘤发生的机理 北京大学
23
70 23 23
Cdlk1基因在非小细胞肺癌中异常高表达及其通过Notch信号通路促进 中中国医学科学院 肿瘤转移的分子机制研究 肿瘤医院 HCRP1负调控EGFR在乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药逆转中的作用及 山东大学 机制
临床相关性
Western-blot
临床样本中检测发现OSM表达差异
图1:OSM与在DCM病人样本和正常对照样本中的相关性研究
wk.baidu.com
细胞功能学实验(细胞水平)
原代心肌细胞检测添加OSM后心肌细胞增殖和去分化的分子marker
图2:OSM促进心肌细胞的增殖和去分化
细胞功能学实验(动物水平,转基因鼠)
图3: OSM促进心肌细胞的增殖和去分化
CRISPR/Cas9技术介绍
CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes
在宿主防御噬菌体攻击中,针对自然界庞大的噬菌体种群,细菌进化了CRISPR介导的适应性免 疫 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列(spacer) 决定 免疫功能的发挥由CRISPR间隔序列的动态性变化,即通过增加或删除间隔序列(spacer)实现
机制性研究(细胞水平检测下游信号通路)
图4: OSM可以通过Obeta激活RAS/RAF/ERK信号通路
机制性研究(动物水平检测下游信号通路)
图5: OSM可以通过Obeta激活RAS/RAF/ERK信号通路
如何寻找一个功能基因 A
文献调研 基因芯片
移植 研究
1.创新度差
2.不一定成功
创新 研究
CRISPR/ Cas9相 关产品 (基因编 辑动物)
至少3只F1代小鼠
至少3只F1代大小鼠
CRISPR/Cas9慢病毒产品
不用筛单克隆细胞株了!
慢病毒双载体
单慢病毒
定位,筛选: GV392:LV-sgCas9-P2A-puro GV393:LV-sgCas9-P2A-EGFP
什么情况下可以使用慢病毒CRISPR/CAS9技术: 找不到有效干扰靶点?基因超过4K?
典型SCI文章精要分析
Circ Res. 2015 Sep 2. pii: CIRCRESAHA.115.306624. [Epub ahead of print] miR-206 Mediates YAP Induced Cardiac Hypertrophy and Survival.
FOXO1
Clin Cancer Res 2012;18
7.84
Oncostatin M Is a Major Mediator of Cardiomyocyte Dedifferentiation and Remodeling
要素分析: A基因-Oncostatin M
C疾病-DCM and Acute MI D功能-Dedifferentiation B基因或信号通路-Ras/Raf/MEK/Erk 亮点:详尽的临床相关性+细胞与动物水平功能实验+合理的机制性研究
科研成果
临床应用
复发与预后
早期诊断 个性化治疗 ……
近年获得资助国自然基金列表选取
项目名称 依托单位 批准金 额 65 70 18 18 43 内质网应激条件下CHOP直接调节p53基因的转录来抑制结肠肿瘤生 复旦大学 长的机制研究 SNAREs介导膜运输障碍与BMPRⅡ关系及其在肺动脉高压发病中的 中国医学科学院阜 作用 外心血管病医院 11β-HSD1通过调节RAS通路介导糖尿病心肌病的作用和机制研究 miR-98通过调控动脉内皮LOX-1表达抑制动脉粥样硬化形成的研究 温州医科大学 安徽医科大学
疾病关键基因研究策略与工具
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
赵治国 Ph.D zhaozg@genechem.com.cn
转化医学的基本思路
临床问题 基础研究
筛选基因 疾病发生 耐药 (相关性研究) 证实功能 (功能研究) 寻找机制 (机制研究) 文章 基金 专利 诊断靶标的发现 个性化治疗标准 药物研发
Donor plasmid HR-L HR-R DNA
Targeted allele
DNA
Homologous Recombination
CRISPR/Cas9技术
使用该技术的文章逐年呈几何级 数增长,最热门的生物技术!
CRISPR/Cas9产品
CRISPR/Cas9 组成型 KO/KI大小鼠 CRISPR/Cas9条件型 KO/KI小鼠 CRISPR/Cas9定点突变 大小鼠 至少3只F1代大小鼠 不同基因操作难度不 同 不同基因操作难度不 同 不同基因操作难度不 同
3. 寻找机制(机制研究): A--B
分子水平:信号通路,相互结合,表达调控,翻译后修饰前,降解调控,剪 切调控,胞内定位等
创新点来自于A,研究成功的关键点是也A
研究的创新点——功能基因 A
功能研究 Pubmed相关 序列号 影响因子 文章数 临床相关性 细胞水平 动物水平 机制研究 1 2 3 0.87 3.693 10.734 1832 23 18 yes NO yes yes Yes yes yes Yes yes
Annu. Rev. Biochem. 2010.79:181-211
第二、三代组成型基因敲除基本原理 Genomic DNA Gene
Genomic DNA
G
ene
Nonhomologous end-joining
Genomic DNA
G
ene
Frameshift mutation
第二、三代组成型基因敲入基本原理 Targeting Wild-type allele
差异基因很多(几百~几千) 如何选择?
功能基因A
芯片下游的工作
~30000个 基因 表达谱芯片 数百~数千个表 达差异个基因 相关基因
功能学验证
引起疾病的因
?
疾病引起的 果 以及平行性 因素
功能基因
基因功能的基本研究方式
1.对目的基因的操作 表达上调,表达下调 无→有,有→无,低→高,高→低 2. 功能(表型)的检测 生长,凋亡,自噬,细胞周期,运 动能力,侵袭,血管新生 ……
J Biol Chem. 2012 Dec 3. Netrin-1 Promotes Glioblastoma Cell Invasiveness and Angiogenesis by Multiple Pathways Involoving Activation of RhoA, Cathepsin B and CREB. Cancer Sci. 2012 Nov 24. Tumor-suppressive microRNA-135a inhibits cancer cell proliferation by targeting the c-MYC oncogene in renal cell carcinoma.
CRISPR/Cas systems
ELIZABETH PENNISI, Science, 2013
Homologous Recombination
Annu. Rev. Biochem. 2008.77:229-257
Non-homologous end joining
Mechanistic flexibility Enzyme multifunctionality Iterative processing
A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能
1.筛选基因(相关性研究): A--C
组织水平:临床组织样本基因的表达情况 临床水平:基因表达水平与各种临床特点的相关性
2. 证实功能(功能研究): A--D
细胞水平:生长,,衰老,炎症反应,凋亡,转移,侵润,血管新生,耐药 动物水平:生长,转移,炎症反应,药物敏感
1.85
胶质瘤 U251、 U87 GOLPH3 胶质瘤 U251、 U87
肿瘤迁 移与侵 袭 增殖与 预后
RNAi,划 痕,侵袭
RhoA
2.41
针对病人样 本(97例) 的预后生存 期判断
RNAi,过 表达, CCK8
_
J neurooncology, 24 August 2012
3.12
成对样本(6 RNAi,过 乳腺癌 对)基因表 增殖与 表达, MCF-7, 达差异,大 肿瘤形 MTT&Brdu, MDA-MD样本(258例) 成 克隆形成, 231 生存期分析 裸鼠成瘤
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