人感染高致病性禽流感标本采集与实验室检测技术方案
人感染H7N9采样方法及实验室检测策略
采集鼻咽拭子注意事项
• 1、采样时用干拭子采，不能蘸采样液，因为采样 液中有抗菌素，防止过敏。
• 2、采样液平时保存在-20℃或-70℃，采样前融化 到4℃。
• 3、采样液颜色呈紫色时失效不能用了。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本 采集方法（2）
• 三、标本运送：
• • 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下随样品送检单24小时
（二）标本转送和检测
• 1.H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染 的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。病 例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机构和病例收治 的医疗机构要密切配合，按照生物安全的相关规定进行包 装，在24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测。
• 2.当地流感监测网络实验室收到标本后24 小时内，立即对 呼吸道标本开展甲、乙型流感病毒通用引物、H5、H7亚型 的检测。
内运送至市CDC流感检测实验室。未能24小时内送至实验 室的，应置-70℃或以下保存；冻存的标本应在冻存条件 下，低温送至实验室。
• 四、采样时的生物安全防护：
• 采样时应带口罩，穿隔离衣，带一次性手套及帽子。若在 现场进行快速检测，应将现场用过的所有废物带回销毁。
谢谢，祝大家工作顺利！
• 若当地流感监测网络实验室检测结果为H5、H7核酸检测 阳性时，应当于24小时内将其中2管呼吸道相关原始标本 分别送省级疾控中心流感网络实验室和国家具备相应生物安全条件的网络实验室可开展病毒 分离，并将分离的毒株按要求及时送国家流感中 心。
• 3.若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型流 感和乙型流感通用引物均阴性时，应当立即将1管 原始呼吸道标本送省级疾控中心。省级疾控中心 收到标本后，应当立即对其中1管进行SARS 、新 型冠状病毒等相关病原体的检测，另1管送国家流 感中心。
人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟， 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管 中。
样本采集方法 (5)
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取 呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负 压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用 采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射 器上来代替收集）。
注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼 吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复 期血清。
要求 呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml 血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml
样本采集方法 (1)
咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤
维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免 接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
胞分类计数减少； 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所
致的肺炎。
• 包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱 液和鼻洗液）；
◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）；
◆ 血清标本；
◆ 如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸 体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；
样本采集方法 (4)
鼻洗液 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患 者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧 杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔
漱口液 用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理
盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
人感染高致病性禽流感应急预案(正文)
人感染高致病性禽流感应急预案1 总则1.1 总体目标为做好人感染高致病性禽流感（以下简称“人禽流感”）防控工作，提高人禽流感的防治水平和应对能力，及时、有效地采取各项防控措施，做到早发现、早报告、早隔离、早治疗人禽流感病例，控制疫情的传播、蔓延，保障广大人民群众的身体健康和生命安全，维护社会的稳定，特制定本预案。
1.2 工作原则政府领导，部门配合；依法防控，科学应对；预防为主，防治结合；群防群控，分级负责。
1.3 编制依据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》、《国家突发公共卫生事件应急预案》、《卫生部应对流感大流行准备计划与应急预案（试行）》。
1.4 适用范围本预案适用于我国各级卫生行政部门及各级各类医疗卫生机构开展的人禽流感防治应对准备及应急处置工作。
2 组织管理2.1 组织机构各级卫生行政部门在本级政府统一领导下，成立人禽流感防控工作领导小组，统一指挥、协调系统内的人禽流感防控工作。
各级各类医疗卫生机构实行人禽流感防控工作主要领导负责制、防控工作责任制和责任追究制，明确任务、目标和责任。
县级及以上卫生行政部门成立由临床、流行病学和实验室检验等相关专业人员组成的人禽流感防控技术专家组。
县级及以上医疗卫生机构成立人禽流感疫情应急处置小组，根据职责分工和卫生行政部门指派，负责开展本单位或本地区的人禽流感疫情应急处置工作。
农村乡镇（村）和城市社区卫生机构在上级疾控机构和医疗机构的指导下，开展本地区的人禽流感防控工作。
2.2 职责分工2.2.1卫生行政部门职责(1)卫生部负责全国人禽流感疫情防控管理和协调工作，组织制订人禽流感应急处置的政策、技术规范和专项预案，指导各地做好人禽流感防控工作；组织开展全国卫生系统专业人员的技术培训，组建国家级专家组为各省（区、市）提供技术支持和培训省级师资，组织专家组对各省（区、市）的年度首例人禽流感病例进行诊断，组织开展对全国人禽流感防控工作的督导检查；负责流感大流行及特别重大的人禽流感疫情应急控制的组织协调及社会动员，拟定国家应急防控物资储备清单，开展人禽流感防控工作的国际交流与合作，指导和协助相关部门开展人禽流感防控知识培训。
禽流感实验室检测技术方案
禽流感实验室检测技术方案禽流感，这个让无数人闻之色变的词汇，已经成为我们生活中无法回避的一部分。
如何快速、准确地检测出禽流感病毒，成为了当务之急。
今天，就让我来为大家详细介绍一下禽流感实验室检测技术方案。
我们需要明确检测的目标。
禽流感病毒有多种亚型，我们要检测的是哪些亚型，需要根据实际情况来确定。
一般来说，H5和H7亚型的禽流感病毒对我国养殖业和公共卫生安全威胁较大，因此，我们将重点检测这两种亚型。
我们要选择合适的检测方法。
目前，实验室检测禽流感病毒的主要方法有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。
病毒分离是传统的检测方法，准确性较高，但操作复杂，耗时较长。
血清学检测通过检测抗体来判断病毒感染情况，速度快，但准确性相对较低。
分子生物学检测，尤其是实时荧光定量PCR技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简便等优点，成为近年来禽流感病毒检测的主流方法。
下面，我将详细介绍实时荧光定量PCR技术在禽流感实验室检测中的应用。
一、实验材料1.样本：采集疑似感染禽流感的家禽咽喉拭子、泄殖腔拭子等。
2.试剂：实时荧光定量PCR试剂盒、病毒提取试剂盒等。
3.仪器：实时荧光定量PCR仪、离心机、恒温箱等。
二、实验步骤1.样本处理：将采集的拭子样本放入病毒提取试剂盒中，按照说明书操作，提取病毒RNA。
2.模板制备：将提取的病毒RNA与实时荧光定量PCR试剂盒中的缓冲液、酶混合，进行模板制备。
4.结果分析：观察实时荧光定量PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线，判断样本是否为阳性。
三、注意事项1.实验过程中要严格遵循无菌操作原则，防止样本污染。
2.实验室人员要具备一定的分子生物学实验技能，确保实验顺利进行。
3.实验结果要及时记录，并与临床诊断相结合，为疫情防控提供有力支持。
通过实时荧光定量PCR技术，我们可以快速、准确地检测出禽流感病毒，为我国养殖业和公共卫生安全保驾护航。
当然，实验室检测只是禽流感防控工作的一部分，我们还需要加强疫情监测、疫苗接种、生物安全等措施，共同抵御禽流感病毒的侵袭。
附7 禽流感实验室检测技术方案范文
附7 禽流感实验室检测技术方案一、实验室网络设置实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。
二、实验室条件及生物安全操作的要求1．省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求（1）实验生物安全要求：安全Ⅱ级+（BSL-2级+）或安全Ⅲ级（BSL-3级）。
（2）特异性H5 的RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测中用到的血凝抑制实验（HI）可以在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室里操作。
（3）特异性H5 的RT-PCR病毒核酸检测在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国家有关核酸检测要求的规定。
（4）微量中和实验、特异性H5 的RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测必须在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
（5）省级流感实验室实验条件：具备进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。
2．国家流感中心实验生物安全要求：生物安全Ⅱ级+（BSL-2级+）和生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室。
3．省级流感实验室职责（1）禽流感标本特异性H5 的RT-PCR病毒核酸检测；（2）禽流感H5的血清学检测工作;（3）特异性H5 的RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离必须在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室；（4）没有生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的分离工作。
4．国家流感中心实验室职责（1）国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；（2）对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；（3）对不具备禽流感病毒分离条件的省份送检标本的检测、分离和确认；（4）对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验；（5）对各省级实验室检测人员的培训；（6）对各省级流感实验室的质量控制。
三、原始标本采集1．标本采集人员医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》做好个人防护。
人禽流感标本采集、运送、处理及保存的操作规程
人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作规程一、目的规范人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作。
二、适用范围本操作规程适用于人禽流感标本的采集、运送、处理及保存。
三、简介人禽流感检测过程中，采集的标本包括鼻咽拭子、漱口液、血液等。
本实验室一般用鼻咽拭子或漱口液进行病毒分离与分子生物学检测，血清用于人禽流感抗体检测，采集血液部位一般位于前臂肘静脉。
四、器材1、用于血液收集的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器、一次性乳胶手套、止血带、碘酒、无菌拭子、血清储藏管、标本标签、创可贴、可封口塑料袋、标本采集表格、带有冰袋的冰壶、棉拭子、污物桶、笔、试管架。
2、用于鼻咽拭子、漱口液等收集的基本耗材包括：一次性乳胶手套、防护服、十二层口罩（或N95口罩）、采样无菌棉签、采样液（螺口塑料管装）、可封口塑料袋、带有冰袋的冰壶、污物桶、样品登记表、笔、试管架。
附：血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；记号笔：油性，防水。
五、人禽流感标本采集操作规程（一）标本采集要求1．采样人员须以无菌操作采集各类标本。
采集标本所使用的容器、采样液等均应无菌。
编制：福建省疾控中心病毒性疾病防治科审核：沈晓娜批准：严延生2. 每份标本必须标明标本编号、标本种类及采集日期。
采集单位应指定专人负责标本的登记、收集和管理，并认真填写“人禽流感标本采集登记表。
”3.所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层清洁塑料袋包裹严实。
4.采集的标本应立即送当地疾病预防控制机构，同时附上标本送检单。
如不能立即送交，可置-20℃以下冰箱短暂保存（24小时之内）。
（二）标本采集种类与方法标本采集的时间、位置及质量对能否分离到病毒或提取到有活性的RNA至关重要，而标本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。
人感染H7N9禽流感病毒PCR检测操作程序
附件医院人感染禽流感病毒核酸检测标准操作程序一、目的确保人感染禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
二、适用范围医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔〕号）和《关于做好医疗机构人感染禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔〕号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染禽流感病毒核酸检测工作。
三、样本采集、运送和保存尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。
可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。
患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（），并组织样本采集人员进行培训及考核。
样本的采集应当严格按照进行。
样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。
若气温高时，需放入冰块降温。
样本抵达实验室后，应尽快进行检测，小时内能检测的样本可置于～℃暂时保存，小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。
如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。
样本避免反复冻融。
样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
四、检测（一）样本处理样本的核酸提取应当在样本处理区进行。
按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。
样本应尽可能新鲜，提取过程应严防酶污染及操作不当导致的降解。
提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。
提取好的应及时用于检测，否则应当-70℃保存。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集-北仑区人民医院
北仑区人民医院检验科人感染H7N9禽流感病毒标本采集、保存、运送实验活动要求根据浙江省卫生厅《关于做好人感染H7N9禽流感病毒实验活动生物安全管理工作的通知》未经培养的临床样本应当在已经市卫生局备案的生物安全二级实验室生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
在生物安全二级实验室开展实验活动时，个人防护应当佩戴眼罩、N95及以上水平的口罩等防护装备。
根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。
原始标本采集呼吸道病毒的诊断取决于高质量标本的采集，及其保存运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
标本采集人员医疗机构的医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照相关要求做好个人防护。
采集前的准备防护用品：1.口罩(N-95 or N/P/R-100)2.手套3.帽子4.鞋套5.防护服6.防护目镜采集物品包参考下图：常用的采样液/病毒运输液(VTM）1.pH 7.4～7.6的Hanks液2.MEM/DMEM液在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。
采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄。
采集对象1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例：（1）发热(腋下体温≥38℃)；（2）具有肺炎的影像学特征；（3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少；（4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
2.人感染H7N9禽流感疑似病例与确诊病例，定义参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版）》标本种类上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液下呼吸道标本：气管吸取物、肺洗液、肺组织标本血清标本：发病7天内急性期血清和间隔2-4周的恢复期血清如病人死亡，可采集组织标本：肺组织、气管、支气管组织等注意事项：1.应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本）。
人感染高致病性禽流感防治技术方案
湖南省澧县人感染高致病性禽流感防治技术方案1．前言高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒引起的一种人、畜、禽共患性急性传染病，属乙类传染病，按照甲类传染病管理。
埋伏期一般在7天以内，早期病症与其他流感非常相似，主要表现为发热、流涕、鼻赛、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，局部患者可有恶心、腹泻、腹痛、稀水样便等消化道病症，有些患者可出现结膜炎，体温多持续39℃以上，一些思者胸部X线还会显示单侧或双侧肺炎，少数患者伴有胸腔积液。
少数患者特别是年龄较大、治疗较迟者病情会迅速开展成进展性肺炎、急性呼吸窘迫综合征等多种并发症，甚至死亡。
为及时有效预防和控制人间高致病性禽流感的发生和流行，根据?人禽流感疫情预防控制技术指南(试行)?和?人禽流感诊疗方案?(2021年新修订)，特制定本技术方案。
2．相关定义医学观察病例有流行病学接触史，1周内出现流感样临床表现者。
对于被诊断为医学观察病例者，医疗机构应当及时报告疾病预防控制中心，并对其进展7d医学观察。
疑似病例有流行病学接触史和：临床表现，呼吸道分泌物或相关组织标本甲型流感病毒M1或NP抗原检测阳性或编码它们的核酸检测阳性者。
临床诊断病例被诊断疑似病例，但无法进一步获得临床检验标本或实验室检查证据而与共有共同接触史的人被诊断为确诊病例，并可以排除其他诊断者。
确诊病例有流行病学接触史和临床表现，从患者呼吸道分泌物标本或相关组织标本中别离出特定病毒，或采用其他方法，禽流感病毒亚型特异抗原或核酸检查阳性，或发病初期和恢复期双份血清禽流感病毒亚型毒株抗体滴度升高4倍及以上。
流行病学史刁；详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检查结果，特别是从患者呼吸道分泌物或相关组织标本中别离心特定病毒，或采川其他方法，禽流感病毒亚型特异抗原或核酸检查阳性，或发病初期和恢复期双份血清禽流感病毒亚型毒株抗体滴度升高4倍及以上可以诊断确诊病例。
3．应急准备制定应急技术方案和有关操作规程根据上级高致病性禽流感防制的总体要求，结合本地历史上的疫情发生情况和规律，科学分析年度疫情发生趋势：制订应急处置技术方案和有关操作规程。
人感染禽流感防控样本采集检测与运送要求市刘爱平
2*reaction buffer 酶 上游引物 下游引物 探针 H2O 模板
12.5ul 0.5ul 0.25ul 0.25ul 0.125ul 6.375ul
5ul 25ul
2024/4/7
24
PCR反响条件
2024/4/7
25
➢呼吸道灌洗液：
➢ 将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气 管〔约30cm深处〕，注入5ml生理盐水，接
通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收
集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次
〔可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代
2024/4/7
9
➢ 咽漱液：用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部 微后仰，发“噢〞声，让生理盐水在咽部转动，然 后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
➢ 禽类粪便：选择禽舍或环境中的新鲜禽类粪便，用无菌拭子 夹或挑取粪便3-5g置于含5ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
➢ 笼具涂抹拭子：用蘸有采样液的拭子擦拭笼具外表禽类最常 接触的3-5个不同部位〔包括笼具底部〕，然后将擦拭过的 拭子放入含5ml采样液的采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。 也可以用多个拭子充分擦拭笼具外表后放到一个采样管中。
➢ 甲型阳性H5、H7亚型阴性的标本继续开展季节性 流感病毒核酸检测和流感病毒别离，毒株上送省 CDC复核。
➢ 甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株 和阳性标本要求在48小时内送至国家流感中心〔 24小时内送至省CDC〕。
没有条件开展 核酸检测的医 疗机构请尽快 开展快速抗原 检测初筛试验。
➢ 甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株 和阳性标本要求在48小时内送至国家流感中心〔 24小时内送至省CDC〕。
H7N9排查病例
高致病性禽流感病毒实验室检测分析
高致病性禽流感病毒实验室检测分析摘要：禽流感即禽流行性感冒，属于甲型流感病毒所致禽类传染性疾病，可在鸡、鸟类中大范围传播。
禽流感包括非致病性、低致病性及高致病性等类型，其中高致病性禽流感具有传播速度快、病死率高及危害性大等特点，并可感染人类，因此国家将其列为一类动物疫病。
为有效防控高致病性禽流感，需采取有效实验室检测方案。
本文分析研究高致病性禽流感病毒实验室检测方法及检查过程中的风险防控措施，希望为相关人员提供参考。
关键词：高致病性禽流感病毒；实验室检测；检测方法高致病性禽流感属于禽类急性传染性疾病，致病菌为甲型流感病毒，其主要特点是传播速度快，病死率较高，可对禽养殖行业造成严重不良影响。
近年来，我国部分地区开展家禽检疫过程中多次检出高致病性禽流感病毒，为此需不断加强实验室检测分析工作，并在检测中采取有效的风险防控措施，以实现对高致病性禽流感的有效防控。
一、高致病性禽流感概述高致病性禽流感属于世界范围多发常见禽类疫病，可对公共卫生安全构成严重威胁。
高致病性禽流感病毒致病性较强，可寄生于多种宿主体内，人类及哺乳动物均可感染，不同禽流感感染病原亚型临床表现存在差异，H7N9亚型感染症状较为严重，可导致呼吸系统病变及多器官功能衰竭，致死率较高，H7亚型感染可导致呼吸道相关症状，H9N2亚型感染症状与普通流感近似[1]。
高致病性禽流感危害性较强，为此需及早确诊，并采取有效的防控措施，以避免其持续蔓延。
二、高致病性禽流感病毒实验室检测方法（一）病毒培养分离病毒培养分离是诊断高致病性禽流感病毒的常规方法，具有较高的灵敏度、特异度及准确度。
实验室检测人员利用临床标本获取毒株，通过培养分离操作技术可确定毒株的生物学特性与抗原基因，进而为疫苗的选用提供参考。
同时，病毒培养分离操作相对复杂，样品运输条件、采用时间及采样方式等均可影响检测结果，不适合应用于普查中。
另外，开展病毒培养分离过程中，高致病性H5N1毒株需在生物安全级别达到BSL-3的实验室中完成[2]。
流感病毒临床标本的采集方法运输保存处理
专用病毒样本采集管
临床标本的采集
常采集的标本类型
?上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽 抽取物、咽漱液和鼻洗液）
?下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺 组织标本）
?血清标本（急性期 / 恢复期） ?肺组织、气管、支气管组织标本 （死亡病例）
标本采集量及分装
?呼吸道标本每份分为 3 管/每管不少于 1ml
? 各省行政部门应该 鼓励具备条件的实验室按 照技术规范 开展标本核酸检测工作 ，并可以 作为诊断的实验室依据。
实验室检测流程 1
? 当地流感监测网络实验室收到标本后 24 小时 内，立即对呼吸道标本开展甲、乙型流感病 毒通用引物 H5、H7亚型的检测。
? 若当地流感监测网络实验室检测结果为 H5、 H7核酸检测阳性时，应当于 24小时内将其中 2管呼吸道相关原始标本分别送省级疾控中心 流感网络实验室和国家流感中心。
人感染H7N9禽流感病毒标本 采集、保存、检测及结果反馈
省CDC 微生物检验科 史永林
2013-04-09
国家卫生和计划生育委员会
?人感染H7N9禽流感疫情防控方案 （第一版）
附件2： 人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略
?人感染H7N9禽流感诊疗方案 （2013年第1版） ? 人感染 H7N9 禽流感医院感染预防与控制技术指 南（2013年版） ? 人感染 H7N9 禽流感病例诊断程序 ?关于做好人感染 H7N9禽流感病毒实验活动生物 安全管理工作的通知
?血清标本每份分为 2 管/每管不少于 0.5ml ? 2 ml螺口带盖塑料管 (不可用1.5ml离心管代替)
临床样本收集的注意事项
? 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我 保护
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案一、采集对象二、采集要求三、标本种类四、标本采集方法五、标本包装六、标本保存七、标本送检八、实验室生物安全九、标本的实验室检测十、检测结果的判断和报告十一、实验室检测流程十二、人禽流感实验室检测职责为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。
一、采集对象1. 人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
2. 其他需要进行人禽流感诊断或排除者。
3. 需要采集的环境标本。
二、采集要求1. 从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。
在标本采集过程中，采样人员参照规定的防护措施进行安全防护。
2. 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
3. 标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
4. 密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
5. 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。
三、标本种类每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
1. 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
2. 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3. 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
4. 血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4周采集。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集、运送及保存
100 A/chicken/Karachi/NARC-23/2003_H7N3_Pakistan A/quail/Aichi/1/2009_H7N6_Japan
87
99
A/duck/Hong_Kong/301/1978_H7N2_Hong_Kong
A/black_kite/Egypt/054/2004_H7N7_Egypt
时-70℃冻存。流感病毒在-20℃～-40℃时不稳 定，故长期保存应在-70℃温度以下，不要冻存 于-20℃，会降低流感病毒的检出率 ➢ 避免反复冻融，冰上一周也比冻融一次要好 ➢ 血清标本暂时存在可在4℃冰箱，长期保存于20℃冰箱。
标本包装和运输
➢ 根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一 版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本 运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致 病性禽流感病毒进行管理
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:– 20℃,4℃可放48–96h,室温1–2天。
➢ 采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻 及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄
采集对象
1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例： （1）发热(腋下体温≥38℃)； （2）具有肺炎的影像学特征； （3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计 数减少； （4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
核酸检测流程
• 若检测结果为甲型通用阳性，H7N9阴性，送剩余 的2份呼吸道相关原始标本送当地市级流感网络实 验室进行其他流感病毒型别鉴定；
• 市级流感网络实验室若不能分型或H5阳性标本应 立即送省级疾控中心流感参比实验室；
• 若检测结果全部阴性，将剩余的2份呼吸道相关原 始标本送省级疾控中心进行SARS、新冠状等病原 体检测；
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附件2人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。
1采集对象1.1人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
1.2其它需要进行人禽流感诊断或排除者。
1.3需要采集的环境标本。
2采集要求2.1从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。
在标本采集过程中，采样人员参照（附件5）规定的防护措施进行安全防护。
2.2住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
2.3标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
2.4密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
2.5根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。
3标本种类每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
3.1上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
3.2下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3.3尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
3.4血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4周采集。
采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。
3.5其它标本：如果病例有腹泻症状，可在发病后采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本。
4标本采集方法4.1咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.2鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.3鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
4.4咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口。
漱口时让患者头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动。
然后将咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。
无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。
4.5深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于50ml含3ml 采样液的螺口塑料管中。
4.6呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
4.7胸水:在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的塑料螺口管中。
4.8肺组织活检标本：在超声或X线定位下,经皮穿刺取肺组织活检标本,置于含3ml采样液的塑料螺口管中。
4.9尸检标本：每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每种组织应多部位取材，各部位应取20～50g，淋巴结取2个。
4.10粪便标本：采集5～10g粪便置于含5～10ml采样液无菌螺口管中，严格密封。
4.11血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。
注：常用的采样液配方为：pH7.4～7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。
在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。
5标本包装标本采集后在生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式三份（分装标本的生物安全柜不能用于提取核酸）。
一份当地检测用，一份送中国疾病预防控制中心检测，一份保存以备复核。
5.1所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的塑料管里，拧紧。
容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。
5.2将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。
5.3标本有关信息填写“疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检单”见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005] 526号），用另一塑料袋密封。
6标本保存用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，24小时内能检测的标本可置于4Ⅱ保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70Ⅱ或以下保存。
如无－70Ⅱ保存条件，则于－20Ⅱ冰箱暂存。
血清可在4Ⅱ存放3天、-20Ⅱ以下长期保存。
标本运送期间应避免反复冻融。
标本应设立专库或专柜单独保存。
7标本送检7.1上送标本检测结果阳性或可疑的原始标本或分离物应及时送中国疾病预防控制中心复核和进一步检测；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例的标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。
7.2标本运送的生物安全要求按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）等有关规定执行。
7.3标本送检的程序各省（区、市）需要向中国疾病预防控制中心送检标本时，应事先与中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室联系。
具体要求见《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]526号）。
8实验室生物安全从事人禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能，在检测的过程中必须采取生物安全Ⅱ级防护。
不同的标本检测生物安全级别要求如下。
8.1标本的分装和核酸提取在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行，病毒培养物的核酸提取必须在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行。
8.2标本的抗原快速检测在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内8.3人禽流感病毒的分离、鉴定必须在生物安全Ⅱ级实验室里进行。
8.4采用灭活抗原进行血凝抑制试验检测血清抗体时，要求在生物安全Ⅱ级实验室内操作。
采用微量中和试验进行血清抗体检测必须在生物安全Ⅱ级实验室操作。
8.5阳性标本和分离物的保存及销毁应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令）执行。
9标本的实验室检测9.1核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time PCR，建议使用国家流感中心或世界卫生组织推荐的引物和探针。
9.2抗原快速检测方法包括ELISA法和金标法，本方法仅具参考价值，不作为诊断依据。
9.3病毒分离及鉴定：采用SPF鸡胚和MDCK细胞分离方法。
病毒的鉴定采用血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验或序列测定。
9.4血清学检测：方法包括微量中和试验、血凝抑制试验、单扩溶血试验。
以上实验室检测方法详见《全国流感/人感染高致病性禽流感监测实施方案》。
10检测结果的判断和报告10.1各检测项目阳性报告10.1.1H5基因核酸检测：A型特异性引物能够扩增出预期大小的产物，两对H5亚型特异性引物都能够扩增出预期大小的产物。
10.1.2抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为10.1.3病毒分离及鉴定：分离出病毒，并经鉴定为H5亚型或H5N1亚型。
10.1.4血清学检测：双份血清抗体滴度4倍或以上增高有诊断意义。
10.2各检测项目阴性报告10.2.1H5基因核酸检测：两对H5亚型特异性引物均不能够扩增出预期大小的产物。
10.2.2抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为阴性。
10.2.3病毒分离：培养物红细胞凝集试验阴性。
10.2.4血清学检测：血清抗体滴度＜1:20为阴性。
10.3H5基因核酸检测不一致两对H5亚型特异性引物扩增出的产物检测结果不一致时，则对阳性扩增产物进行测序，如果为H5N1病毒序列，则判断为阳性。
标本检测结果有关信息填写“人感染高致病性禽流感标本检测结果反馈表”（具体见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》中疾控疾发[2005] 526号）。
11实验室检测流程应采集人禽流感检测对象上呼吸道标本和下呼吸道标本进行禽流感病毒的核酸检测和病毒分离，同时要采集病例的急性期和恢复期血清标本进行H5N1亚型特异性抗体检测。
原则上，先由省级及以下疾病预防控制机构进行初步检测，阳性标本送中国疾病预防控制中心复核；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。
省级疾病预防控制机构不具备检测条件的，送中国疾病预防控制中心或邻近具备相应条件和资格认证的省级疾病预防控制机构进行检测。
具体步骤见人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图。
12人禽流感实验室检测职责12.1中国疾病预防控制中心职责12.1.1对省级以及其它人禽流感检测实验室的检测结果进行复核，并对上送的标本做进一步检测。
12.1.2对不具备禽流感病毒核酸检测、病毒分离条件的省级上送的标本进行检测。
12.1.3对需做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验。
12.1.4对分离到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。
12.1.5及时向送检标本的机构反馈检测结果。
12.1.6对省级疾病预防控制机构实验室人员进行实验室技术和生物安全培训。
12.1.7对省级疾病预防控制机构实验室提供技术和试剂支持并进行质量控制。
12.1.8对省级疾病预防控制机构的实验室检测和生物安全工作进行督导。
12.2省级疾病预防控制机构职责12.2.1对辖区内人禽流感标本的采集工作提供技术指导和物质支持，必要时直接参与标本的采集。
12.2.2按照生物安全要求，对采集到的标本进行禽流感病毒的核酸检测、血清学检测和抗原检测。
获得国家认证的生物安全Ⅱ级实验室才可开展病毒分离和微量中和试验。
12.2.3按照生物安全要求妥善保存原始标本或禽流感病毒株。
12.2.4符合上送条件的标本或毒株按规定及时送中国疾病预防控制中心。