酵母菌诱变育种

酵母菌原生质体融合育种

第一部分：酵母菌原生质体融合育种

一、基本原理

进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子

二、实验材料

（一）菌种：酵母菌

（二）培养基：

1、完全培养基（液体CM）

2、完全培养基（固体CM）在液体培养基加入2%琼脂

3、基本培养基（MM）葡萄糖柠檬酸钠培养基或YNB培养基

4、再生完全培养基固体完全培养基中加入0.5mol/L的蔗糖

(三) 缓冲液

(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。

(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。

(四) 原生质体稳定液(SMM)

0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。

(五) 促融剂

40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。

(六) 器皿

培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。

四、试验内容

(一) 原生质体的制备

1．活化菌体

将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。

2．离心洗涤、收集细胞

分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。将二株菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀，分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个平板)，用刮棒涂布，30℃培养48

h 后进行二亲株的总菌数测定。

3. 酶解脱壁

各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1％EDTA 和0.3％SH-OH）于30℃振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。

(二) 原生质体再生及剩余菌数的测定

1．再生

分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再生培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行再生菌数测定(用双层再生培养基)。

2. 未脱壁菌数测定

分别取0.5 mL 原生质体至装有无菌水试管中，稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。

(三) 原生质体融合

1. 除酶

取两亲本原生质体各1 mL，混合于灭菌小试管中，2500 r/min 离心 10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。

2. 促融

向上述沉淀菌体中加入0.2 mL SMM 溶液，混合后再加入1.8 mL 40％PEG，轻轻摇匀，32℃水浴保温2 min 立即用SMM 溶液适当稀释(一般为100、10-1、10-2)。

3．再生

取融合后的稀释液各0.1 mL，放于冷却至45℃左右的6 mL 固体再生基本培养基试管中，迅速混匀，倒入带有底层再生培养基的平板上，每个稀释度做两次重复，30℃培养96 h，检出融合子。

4．融合子的检验

用牙签桃取原生质体融合后长出的大菌落点种在基本培养基平板上，生长者为原养型即重组子。传代稳定后转接于固体完全培养基斜面上，而亲本类型在基本培养基上是不生长的。

补充：原生质体融合育种

一、方法：用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子。

聚乙二醇诱导和电融和

聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高10倍。

二、原生质体融合育种的特点

1、杂交率高

2、受接合型或致育型的限制小

3、遗传物质传递更为完整

4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能

5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株

6、提高菌株产量的潜力较大

7、有助于建立工业微生物转化体系

三、原生质体融合育种五大步骤：

Ⅰ、直接亲本及其遗传标记选择；

一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为直接亲本

直接亲本都带有遗传标记

Ⅱ、双亲本原生质体制备与再生

（一）原生质体制备