临床微生物检验_实验六
医学检验—微生物基础(六)
医学检验—微生物基础（六）培养基一、分类1.营养琼脂：标本及各类细菌的增菌培养。
【基础培养基】2.血平板：各类细菌检验标本的分离。
【营养培养基】3.巧克力平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
【营养培养基】4.中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板：筛选革兰阴性细菌；鉴别发酵型革兰阴性杆菌菌种。
【弱选择培养基】5.麦康凯平板：筛选革兰阴性杆菌和非发酵菌。
【弱选择培养基】6.SS琼脂：筛选肠道致病菌，如志贺菌和沙门菌。
【强选择培养基】煌绿可以抑制大肠埃希菌7.碱性琼脂或TCBS琼脂：从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。
8. 真菌培养基：沙保弱培养基二、血琼脂上的溶血1.α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。
2.β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。
3.γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。
4.双环：双层溶血环，内层为β溶血，外层为α溶血。
如产气荚膜梭菌。
三、气味1.铜绿假单胞菌（生姜气味）2.变形杆菌（巧克力烧焦气味）3.厌氧梭菌（腐败的恶臭味）4.放线菌（泥土味）等。
四、细菌在液体培养基中的生长现象1.浑浊生长：大多数细菌。
2.沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。
3.菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。
五、细菌在半固体培养基中的生长现象1.有鞭毛在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。
2.无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。
六、细菌非培养检测方法1.细菌毒素检测内毒素：鲎试验常见于革兰阴性菌感染外毒素：体内及体外毒力实验常见于革兰阳性菌及部分阴性菌。
2.实验动物①无菌动物：就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。
②悉生动物：给无菌动物引入5-17种正常肠道菌群培育而成的动物③无特殊病原动物:无特定的微生物或寄生虫的动物④清洁动物：不带有人畜共患病原或烈性传染病病原及常见传染病病原的动物⑤常规动物：在自然环境中饲养的带菌动物七、细菌的自动化检测1.自动血培养检测系统基本原理：检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳（C02）来作为血液中有无微生物存在的指标。
6 实验六 TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反应素
操作方法
5．用平板混合器(或用手轻轻撞击敲动)以不会导致微 量反应板孔内容物溅出的强度混合30秒钟，加盖后于 室温(15～30℃)下水平静置2小时后或次日，在观察 镜上记录并观察其反应图像，或者利用免疫稀释判定 装置进行测定。见表3。
操作方法
表3 凝集法操作步骤 Well No. 1 25 2 25 25 3 25 25 25 25 1:40 25 25 1:80 1:160 1:320 4 25 25 5 25 25 6 25 25 25
三、梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验 (treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)检测梅毒螺旋 ， 检测梅毒螺旋 体抗体
（一）实验原理
TPPA是将梅毒Treponema Pallidum(Nicho1s株) 的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上。这种 致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体(TP)抗体进行反应发 生凝集，产生粒子凝集反应(Particle Agglutination Test；PA法)，由此可以检测出血清或血浆中的梅毒 螺旋体(TP)抗体，并且可用来测定抗体效价。
本次实验以梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验 (treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体和 梅毒甲苯胺红不加热血清试验(syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST)检测血清中的反 应素。
五、实验讨论与思考题
凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现 肉眼可见的反应。一般情况下，随着血清浓度的逐渐 稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反 而无凝集现象出现，此为前带现象。出现该情况时， 须加大抗体稀释倍数重新试验。
实验六-IMViC实验
3.某公司推出一种新饮料，并声称是100％纯天然产品，不含 防腐剂，利用你所掌握的微生物学知识，试设计一个简单 实验来初步判断此饮料是否含有防腐剂？
实验42 IMViC与硫化氢试验
实验目的：
学习掌握IMViC与硫化氢试验原理 了解IMViC与硫化氢试验反应的原理及其在肠道菌 鉴定中的意义与方法
实验原理：
甲基红试验是用于检测由葡萄糖产生有机酸如甲酸、乙酸、乳酸 等，当细菌分解糖产酸，培养基中的甲基红指示剂由橘黄 （pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
甲基红 甲基红 +
大肠杆菌＋ 产气杆菌－
c. Voges-Proskauer (V－P) Test
抑(杀)菌圈的大小，能够反应化学消毒剂抑(杀)菌能力的大小
思考题
1.含化学消毒剂的滤纸片周围形成的抑(杀)菌圈表明该区域 培养基中的原有细菌被杀死或被抑制而不能进行生长，你 如何用实验证明抑(杀)菌圈的形成是由于化学消毒剂的抑 菌作用还是杀菌作用？ 2.影响抑(杀)菌圈大小的因素有哪些？抑(杀)菌圈大小能否准 确的反映出化学消毒剂抑(杀)菌能力的强弱吗？
实验步骤
培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
菌种：大肠杆菌
溶液或试剂：
2.5%碘酒、0.1%升汞、5%石炭酸（苯酚）、75%乙醇、1%来 苏尔（甲酚皂消毒液）、0.25%新洁尔灭（苯扎溴铵溶 液）、无菌生理盐水
仪器或其他用具：无菌培养皿、无菌滤纸片、无菌枪尖
滤纸片法测定化学消毒剂的杀(抑)菌作用
1.熔化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，冷却至50℃ 左右，在操净 台上倒平板，4个人一组，每人一个平板，水平放置待凝 固； 2.用无菌枪尖吸取0.2ml培养18h的大肠杆菌菌液加入到平板 中，用无菌的三角涂棒涂布均匀； 3. 已涂布好的平板，将皿底划分成6等份，每一等份内标明 一种消毒剂的名称； 4.用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(5mm)分别浸入装有各 种消毒剂的平皿中浸湿，再将浸湿后的滤纸片贴在平板相 应区域，在平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为 对照； 5.将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃ 培养箱中， 48h后取出观察抑(杀)菌圈的大小
实验六微生物大小测定
长 宽
结果计算 长μm＝平均格数×校正值 宽μm＝平均格数×校正值 大小表示：宽μm×长μm
思考题
1、 P51： 思考题2（2） 2、 P113： 思考题1（1） 预习实验七：微生物的生理生化反应
一、实验目的 二、实验原理 三、实验器材 四、实验内容步骤
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目镜测微尺外观
镜台测微尺外观
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1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×16×104 稀释倍数
或
1ml菌液中的总菌数=平均每小格的菌数×400×104× 稀释倍数
本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右 即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格 的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中 见图：即本格中计数细胞为3个。
显微镜计数
返 回
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显微镜直接计数法
• 利用血球计数板直接在显微镜下计数微生 物的细胞（或孢子）数目 • 优点：直观、快速、操作简便 • 缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运 动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察
计数公式
1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104× 稀释倍数
目 镜 测 微 尺 放 大
0
10
20
30
40
50
镜 台 测 微 尺 放 大
返 回
目 镜 测 微 尺 的 标 定
目镜测微尺
0 10 20 30 40 50
微生物细胞
镜台测微尺
两条重合线间镜台测微尺的格数 目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间目镜测微尺的格数 ×10
一、实验目的 二、实验原理 三、实验器材 四、实验内容步骤
返 回
装目镜测微尺 目镜测微尺的格数标定
实验六 微生物细胞大小的测定
实验六微生物细胞大小的测定一、目的要求1.学会测微尺的使用和计算方法。
2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。
二、基本原理微生物细胞大小, 是微生物的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。
由于菌体很小, 只能在显微镜下测量。
用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。
一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格）,每格长度等于0．01mm（即106μm）。
是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片, 其中央刻有精确的刻度, 有等分50小格或100小格两种, 每5小格间有一长线相隔。
由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同, 目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同, 因此,目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小, 在使用前必须用镜台测微尺进行校正, 以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值, 然后才可用来测量微生物的大小。
三、器材枯草芽孢杆菌染色玻片标本, 目镜测微尺, 镜台测微尺, 显微镜, 擦镜纸, 香柏油等。
四、操作步骤1. 目镜测微尺的标定(1)放置目镜测微尺取出接目镜, 旋开接目镜透镜, 将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图Ⅳ-4, B）, 然后旋上接目透镜, 最后将此接目镜插入镜筒内（图Ⅳ-4, C）。
(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上, 使刻度面朝上。
(3)校正目镜测微尺先用低倍镜观察, 对准焦距, 当看清镜台测微尺后, 转动接目镜, 使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行, 移动推动器, 使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合, 然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图Ⅳ-6）。
根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数, 通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。
目镜测微尺每小格长度（μm）=同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
实验六 环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应
环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。
2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。
3.练习单菌落划线分离微生物。
二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。
而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。
温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。
微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。
粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。
常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。
根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。
常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。
许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。
不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。
产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。
青霉素主要抗G＋细菌。
链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。
链霉素以抗G－细菌为主。
紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。
另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。
紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。
紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。
实验六微生物的生理生化反应.
实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握i 微生物（细菌）鉴定中主要生化反应的常规实验法二、实验原理（一）大分子物质（如淀粉、明胶）在常规条件下不被降解成小分子物质，但某些微生物细胞能分泌胞外酶，使大分子物质降解。
大分子物质在微生物分泌的胞外酶的作用下分解成小分子物质。
1. 淀粉水解实验根据淀粉遇碘变蓝的原理，向含有淀粉培养基中加入碘产生淀粉酶无色透明圈微生物细胞无淀粉酶蓝色2. 明胶水解实验产生明胶酶的，明胶培养基在4 度时成液体状微生物细胞无明胶酶时，在明胶培养基在4 度成固体状（二）糖发酵实验不同的细菌分解糖，醇的能力不同，有些细菌分解某些糖产酸并产气，有的分解糖仅产酸而不产气，因此，可根据其分解利用糖的差异作为鉴定菌种的依据之一。
在糖发酵实验中，用溴甲酚紫作为指示剂，PH6.8时为紫色，当PH< 5.2时变为黄色，若细菌分解糖产酸，则培养液由紫色变为黄色，有无气体产生，可以从德汗氏小管中观察。
（三）IMVC 实验IMVC 实验主要包括吲哚（indol test）试验、甲基红（methyl red test）试验、柠檬酸盐（citrate test）试验、伏-普（Voges-Prokauer test）试验，这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细菌学检查甲基红试验（M.R.试验）某些细菌在糖代谢过程中，分解培养基中的糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸，乙酸等，使培养基的PH 值降至4.5 以下。
酸的产生可由甲基红的变色来指示。
甲基红的变色范围是PH4.2-6.3，PH4.2 时为红色，PH6.3 时为黄色。
若细菌分解葡萄糖产酸量少时，则培养基PH 值在6.3以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。
伏普试验有些细菌可以分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧产生乙酰甲基甲醇。
在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，二乙酰可以与培养基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基产生红色化合物。
实验六、微生物细胞的大小测量和显微计数目
10
计数规则：
1）要求每小格内约有5－10个菌体为宜；
2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；
3）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞；
4）酵母出芽，又未脱离母体的，只有当芽体大小达到母细胞的
一半时，即作为两个菌体计算；
操作要点：
•血球计数室要清洁。
•观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。
操作要点： • 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。 • 换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏 镜头。
2、显微直接计数
1）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上→ 观察熟悉计数室的中 方格和小方格 → 取下血球计数板→用自来水冲洗计 数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净→ 置 干燥箱干燥 。
精选ppt课件
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2）样品中酵母菌细胞的直接计数：
取干净血球计数板→ 在计数室上方盖上盖玻片→ 用无 菌吸管，吸取摇匀的酵母菌稀释液→ 在盖玻片边缘沾 一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透作用进入计数室→ 静置5min → 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细 胞数→ 完毕后清洗血细胞计数板→ 冲洗、干燥
精选ppt课件
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二、基本原理
1、微生物细胞大小的测量
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也 是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要 在显微镜下，借助特殊测量工具――测微尺（包括 镜台测微尺和目镜测微尺）。
测微尺原理：镜台测微尺是中央部分刻有精确等 分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长 0.01mm(即10μm)。镜台测微尺并不直接用来测量细 胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长 度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。
微生物学实验六、衣原体、立克次体、真菌、病毒包涵体、单层细胞培养。
2、培养：在无活细胞的培养基中不能生长；
3、抵抗力：
极弱，对青霉素、 红霉素、砷剂敏感。
钩端螺旋体
钩体为圆柱型，长约 6-12µm，直径0.10.2µm。可见螺旋盘绕细 密、规则似细小珍珠排列 的细链，常呈C、S或8字 形。
常用镀银染色法染色，染 成棕褐色.
钩端螺旋体
回归热疏螺旋体
3. 与疾病有关的：
• 疏螺旋体属: 伯氏疏螺旋体 • 密螺旋体属: 梅毒螺旋体 • 钩端螺旋体属: 钩端螺旋体
梅毒螺旋体
1、形态与染色：TP菌 体细长，长约7-8μm,直 径0.10-0.15μm. 有814个致密而规则螺旋， 两端尖直，运动活泼。
用普通染料不易着色， 常用镀银染色法染色， 染成棕褐色
分 类：
对人致病的立克次体包括五个属： 1、立克次体属 斑疹伤寒群 (Rickettsia) 斑点热群 2、柯克斯体属(coxiella) 3、东方体属（Orientia,包括恙虫病群） 4、埃立克体属(Ehrlichia) 5、巴通体属（Bartonella,包括罗沙利马体）
一、生物学性状：
（一）形态与染
病毒感染细胞后，在胞浆或胞核内出现 嗜酸或嗜碱性的圆形、椭圆形、不规则 形斑块结构。
狂犬病病毒包涵体（内基小体）
七、单层细胞培养
1，取出鸡胚，放在无菌培养基中，将鸡胚剪成小块 2，胰酶消化：用胰酶使大量的细胞游离. 3，将细胞悬液放于37℃温箱孵育。 4，培养48h后长成单层，镜下可看到一层活细胞，
培养特性：营养要求高、专性需氧(馋)
生长缓慢,2-4W才见菌落(懒) 呈乳白色或米黄色，不透明，粗糙型颗粒状， 结节状，菜花状菌落(丑)。
微生物实验六糖发酵实验
林标声
实验六 糖发酵实验
• 一、实验目的
• 1、了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中
的重要作用。
二、实验原理
• 糖发酵试验是最常用的生化反应【糖发酵实验，I MVIC实验（吲哚、甲基红、伏普、柠檬酸盐实验 ）】，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在 分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解 某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体 （如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸 不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸 并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不 能分解乳糖；枯草芽孢杆菌分解葡萄糖产酸产气 ，不能分解乳糖，普通变形杆菌能分解葡萄糖产 酸、产气，但不能分解乳糖。
产酸产气的鉴定
产酸的判断：指示剂溴甲酚紫(pH5．2为黄 色，pH6．8为紫色)，当发酵产酸时，使培 养基由紫色变为黄色。
产气的判断：倒置的德汉氏小管（有无气泡）
糖发酵试验结果： 右侧为空白对照， 左侧为发酵产酸阳 性，但不产气，中 间为产酸、产气
三、实验器材
• 大肠杆菌，普通变形杆菌斜面各1支；盛有葡萄糖发酵培养基的试管和乳糖发酵培养基 的试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管），试管架，接种环等。
五、实验结果
糖类发酵
大肠杆菌 普通变形杆菌
对照
葡萄糖发酵
乳糖发酵
将实验结果填入下表。分别用产酸产气、产酸不 产气、不产酸不产气表示
六、思考题
• 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
感谢下 载
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气酸并产气伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气不能分解乳糖枯草芽孢杆菌分解葡萄糖产酸产不能分解乳糖枯草芽孢杆菌分解葡萄糖产酸产气不能分解乳糖气不能分解乳糖普通变形杆菌能分解葡萄糖普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气但不能分解乳糖产酸产气但不能分解乳糖
实验6-微生物的生理生化反应
实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。
2、实验过程简述2.1 培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、α-甲基葡萄糖苷的YNB 培养基，放入一根杜氏管。
2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB 的固体、液体培养基。
2.1.3 乙醇发酵用种子培养基：YPD 培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。
2.1.5抗生素效价测定用培养基：LB 培养基2.1.6青霉素：用pH 6.0 磷酸缓冲液配制，浓度为100 mg/ml，0.22μm 孔径过滤灭菌。
2.2 微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。
2、取200 μl 菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48 h。
3、每24 h 观察记录生长和产气情况。
4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。
2.3 微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。
2、取200μl 菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30℃或37℃静置培养48 h。
3、各取20μl 菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，培养皿倒置，静置培养48 h。
4、每24 h 观察记录生长情况，48 h 测定液体培养物的OD 600。
5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。
2.4 酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD 种子培养基中，30℃，200rpm，培养18 h。
2、乙醇发酵：按照10%（v/v）的比例将培养好的种子液接入100 ml 发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30℃，静置培养，每24 h 手摇1 次，发酵3-4 d。
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
临床生化检验：6-线性范围试验
• 3.稳定性 （1）效期稳定性 （2）热稳定性试验 （3）开瓶稳定性
实验目的
•掌握检测临床生化检验商品试剂盒测定 线性范围的原理和方法,剂量反应曲线的 绘制,统计方法和性能评价;
•熟悉线性范围变窄的原因;了解影响线性 的因素.
原理
使用不同浓度的葡萄糖标准溶液,用GODPOD法试剂测定各自的吸光度,以标准浓 度为横坐标,以其对应的吸光度为纵坐标, 在方格纸上作图.即可绘制出一条直线,即 剂量反应曲线(dose-response curve).
2.线性评价统计 采用回归分析,求出此直线的截距a和斜 率b,建立直线回归方程y=a+bx;并作相关分析,求出相 关系数(r), r2≥0.995认为此浓度范围内的溶液与吸光度 呈良好的线性关系。
注意事项
1.葡萄糖标准液的加量必须十分准确,应用计量 性能准确度很高的微量进样器加样。
2.本方法线性可达22.24mmol/L,(指生化分析仪) 造成线性变窄的原因试剂配料中组分投料不 足;试剂配制后组分稳定性差;因运输或储存 不当等导致试剂组分的含量发生变化。
1、线性范围：
• 在试剂盒评价中很重要,是指试剂盒按 说明书使用可准确测量的范围。试剂盒 测定线性范围是衡量其质量的重要指标 ,也是鉴定试剂盒和保证正确使用的关 键指标之一。
2.酶促反应时间曲线或化学反应速度时间 曲线观察
• 以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标 作图，观察动态期（包栝延迟期，线性 期，混和期）和平衡期出现，持续和终 止的时间，分析有关性能指标。
试剂与器材
• 40mmol/L葡萄糖标准液 • 蒸馏水 • GOD-POD试剂盒 • 可见分光光度计 • 水浴锅
操作步骤
加入物
0
葡萄糖标准液(ul) 0
微生实验报告2012.11.14实验六、土壤中微生物的分离和纯化,微生物的培养特征观察
微⽣实验报告2012.11.14实验六、⼟壤中微⽣物的分离和纯化,微⽣物的培养特征观察微⽣实验报告姓名：王晶晖专业年级：2011级⽣物技术学号：040312011032实验六⼟壤中微⽣物的分离和纯化, 微⽣物的培养特征观察,环境中的微⽣物⼀、实验⽬的1、学习掌握倒平板的⽅法和⼏种分离纯化微⽣物的基本操作技术2、了解不同微⽣物在液体,半固体,固体培养基上的培养特征3、学习并掌握各种⽆菌操作接种技术⼆实验原理1、微⽣物的分离纯化原理⾃然条件下的微⽣物往往是不同种类微⽣物的混合体。
为了研究某种微⽣物的特性或者要⼤量培养和使⽤某种微⽣物，必须从这些混杂的微⽣物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的⽅法称为微⽣物的分离与纯化。
在⾃然界中，上壤是微⽣物⽣活的良好环境，其中⽣活的微⽣物数量和种类都是极其丰富的。
⼟壤中的微⽣物数量与种类⾮常多,在通⽓良好的花园⼟中，好⽓性微⽣物占有绝对优势。
本实验以花园⼟为材料分离⼟壤中的好⽓性细菌。
分离微⽣物常⽤的⽅法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采⽤不同⽅法，其最终⽬的是要在培养基上出现欲分离微⽣物的单个菌落，必要时再对单菌落进⼀步分离纯化。
在⽤稀释平板法分离微⽣物时，还可以同时测定待分离的微⽣物的数量。
倒平板的⽅法稀释平板计数法中样品的稀释和稀释后的取样培养平板涂布法平板划线分离法（a）交叉划线法。
（l、2、3、4为依次划线的起点）；（b）连续划线法（1、 2⼒依次划线的起点）；（c）划线操作2 微⽣物的培养特征原理1) 微⽣物的菌落特征在固体平板培养基上，单个微⽣物细胞或孢⼦⽣长繁殖可以形成⼀个具有特定形状的菌落。
在⼀定的培养基上和⼀定培养条件下，微⽣物的菌落特征是稳定的，因此通过菌落的观察可以识别细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等⼏⼤类微⽣物。
菌落的基本特征包括菌落形状、⼤⼩、边缘、隆起度和颜⾊等。
2)微⽣物的培养特征是指微⽣物培养在培养基上所表现出来的群体形态和⽣长情况。
实验六 微生物大小测定
实验六 微生物大小测定
六、实验作业 1、实验结果 （2）将各菌测定结果记录填入表2、3和4中。 表2 金黄色葡萄球菌大
实验六 微生物大小测定
实验六 微生物大小测定
一、实验目的 1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大 小的方法； 2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学 基本要求，增强对微生物细胞大小的 感性认 识。
实验六 微生物大小测定
二、实验原理
镜台测微尺：一个特制在载玻片中央封固的标准尺， 其尺度总长为1mm。10大格×10小格=100个小格， 每一小格长度为0.01mm，即为10µm。作用：不是 直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微 尺每格的相对长度。
显微镜测微 尺（特殊的 测量工具）
目镜测微尺：一块可放入接目镜内的圆形小玻片， 中央有精确的等分小刻度：一般有等分为50小格 和100小格的两种。
实验六 微生物大小测定
三、实验仪器与用具 接种环、酒精灯、火柴、试管架、显微镜、擦 镜纸、双层瓶、目镜测微尺、镜台测微尺等 四、实验材料与试剂 大肠杆菌（E.coli）24h牛肉膏琼脂斜面培养物； 枯草芽孢杆菌（B.subtilis）牛肉膏蛋白胨营 养琼脂斜面培养物；金黄色葡萄球菌 （S.aureus）16h牛肉膏蛋白胨营养琼脂斜面 培养物；香柏油、二甲苯等
六、实验作业 1、实验结果 （2）将各菌测定结果记录填入表2、3和4中。 表3 枯草芽孢杆菌大小测定记录
1 长度 宽度 2 3 4 5 6 7 8 9 10
实验六 微生物大小测定
六、实验作业 1、实验结果 （2）将各菌测定结果记录填入表2、3和4中。 表3 大肠杆菌大小测定记录
实验6 水中大肠菌群
实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测一、实验目的1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。
2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。
二、实验原理如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。
由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。
大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。
即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。
它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。
当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。
本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。
本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。
测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。
三、实验材料1.培养基；1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，胆酸钠：5.0g将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。
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v I
S d1 d2 抑菌圈直径（mm)
纸片扩散法材料与判断
抗菌药物纸片：直径6.0--6.35mm，吸水量为
20μl的滤纸。
培 养 基：MH琼脂，pH7.2--7.4，琼脂
涂片、干燥、紫外杀菌、固定
1.初染： 石炭酸复红溶液 加热至冒白烟 5min
2.媒染： 3%盐酸酒精溶液 3min
3.复染：碱性美蓝溶液 1min
结果观察
结核分枝杆菌的形态 抗酸染色阳性 蓝色背景下菌体红色。 菌体细长略弯曲 有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列。
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
抑菌圈直径的测量
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性评价
抗菌药物 纸片含药量
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 环丙沙星 克林霉素
10U 1ug 30ug 10ug 5ug 2ug
抑菌环直径(mm)
R
I
S
≤28
-
≥29
≤10
11-12
≥13
-
-
≥15
≤12
13-14
≥15
厚度4mm
菌液浓度和接种：0.5麦氏浊度，15min内接
种完毕。
结果判断与报告：S（敏感）、I（中介）、
R（耐药）
质
控：采用标准菌株进行
药敏质控。
质量控制：采用质控菌株
肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
纸
铜绿假单胞菌：大肠埃希菌ATCC25922
片
ATCC35218
扩
铜绿假单胞菌ATCC27853
>24 >15
影响因素
u 培养基的质量 u 药敏纸片的质量 u 菌液的浓度、纯度、接种菌量 u 孵育的温度和观察时间 u 操作质量，等
分枝杆菌与抗酸染色
目的要求
1.掌握抗酸染色的原理、方法和结果判断。 2.掌握结核分枝杆菌的形态。
试剂和器材
卡介苗、抗酸染色液、玻片，等
抗酸染色原理
细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸 ，一 般不易着色，如果经加温或延长染色时间而着 色，一旦着色，能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱 色，所以又称抗酸杆菌。
第二天实验内容
1.K-B法药敏试验 结果分析
琼脂稀释法药敏试验（1 份/组）
1. 配制不同浓度抗菌药物 2. 配制含不同浓度抗菌药物 的MH平板（共11个平板） 3. 点种金葡菌及铜绿于以上 MH平板中
药敏结果判断
用刻度尺量取抑菌环直 径，抑菌环 的边缘以肉 眼见不到细菌明显生长 为限。
根据CLSI标准: 敏感(susceptible,S) 耐药(resistant,R) 中介(intermediate,I)
抗酸染色的注意事项：加热
报告方式： 萋尼氏染色镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性 (－)：连续观察300个油镜视野未
发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1～9条/300视野。 抗酸杆菌阳性（1＋）：1～9条/100视野。 抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。 抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野
散 法
不 动 杆 菌 等： 大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
铜绿假单胞菌ATCC27853
葡 萄 球 菌 属：金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC35218
肠 球 菌 2020-10-10 属：粪肠球菌ATCC29212
9
纸片扩散法的步骤
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，制备成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
临床微生物检验
实验六
实验目的
问1 题掌 作握 方抗 法菌、药结物果敏判感读试及验其的影原 响理 因、 素操 2
2
掌握抗酸染色法的原理、操作方法 及其注意事项
3
掌握镀银染色及TPPA、TRUST试验 原理、方法、结果判断和临床意义
第1天实验内容
1.药敏试验
药敏纸片选择：
1个MH平板/人
金黄色葡萄球菌：PG、OX、VA、CLI、CIP、GEN 铜绿假单胞菌：CAZ、GEN、PIP、CIP、IMP AK
2.抗酸染色
什么是CLSI?
美国临床实验室标准化协会 Clinical and Laboratory Standards Institute
什么是ATCC?
美国典型培养物（标准菌种）收藏所 American Type Culture Collection
K-B药敏法敏感试验
掌握：纸片扩散法（K-B 法）原理 操作方法、结果判读和影响因素
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
纸片扩散法的步骤
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余 菌液；
4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平 板60度；
5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化
熟悉：纸片扩散法的质量控制
主要试剂和器材
菌种：金葡或铜绿 MH 培养基、0.5 麦氏比浊管（比浊仪） 无菌生理盐水、各种药物纸片等
纸片扩散法（K-B 法）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上
纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸 片周围扩散形成递减的梯度浓度
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
结核分枝杆菌的分离培养
培养基（L-J培养基=罗氏培养基） 培养条件（专性需氧、较长时间） 菌落特征
固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒 状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。
菜花样菌落
结核杆菌（L-J培养基）
课后小结
药敏结果的判断及CLSI标准
的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片 中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于 15mm。
纸片扩散法的步骤
7. 35℃孵育16～24小时量取抑 菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
①
②
③
④
⑤
⑥
药物敏感试验操作示意图
注意事项
●纸片及培养基要放置室 温平衡; ●菌液浓度要准确; ●平板涂布要均匀; ●各抗菌纸片中心距离应 大于24mm; ●纸片中心距平板内缘应 大于15 mm; ●纸片贴上后，不能移动。