流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群_百替生物
流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立_聂咏梅
Flow CytometricMethodforHumanPlateletsCountinginMouseWholeBlood NIE Yong-mei☆, DeborahF. Dumont, LarryJ.Dumont.☆GuangzhouBloodCenter, Guangzhou510095, China. 【Abstract】 Objective Tosetupaflowcytometricmethodforhumanplatelets(hPLTs)countinginmousewhole blood(MWB).Methods MWBwascollectedviacardiacpuncturefromSCIDmicesacrificedwithCO2 andpreserved withEDTA.Humanplatelets(hPLTs)werepreparedfromapheresisplateletsandmixedwithMWB(V/V=1∶4).Subsequently, mixedspecimenwerefixedby1% coldparaformaldehyde, heldovernightat4℃, washedandresuspendedwith 1% PBS/1% FBS.Fourgroupswereset, includingtwopositivecontrolgroups, oneexperimentalgroupandoneisotype control.Plateletswerecountedbyflowcytometry.ConcentrationofhPLTswhichdesignedasexpectedhPLTswasmeasuredbyADVIA120 hematologysystem(Bayer).Theoriginalmixedspecimenwasdilutedby10, 100, 1 000, 10 000 and100 000 -foldwithMWB.Themixedbloodwasthendouble-stainedwithPE-CD41 andFITC-CD61 inTruCOUNTtubetomeasuredhPLTs, whichwasdesignedasmeasuredhPLTs.Correlationwasanalyzedbetweentheexpected andmeasuredhPLTs.Results Humanplateletsweresuccessfullycountedbyflowcytometry.Nofalsepositiveorfalse negativeresultwasobserved.GoodcorrelationbetweenexpectedandmeasuredhPLTswaspresentedrangingfrom3 000 to 150 000/μL.Conclusion hPLTscanbecountedbytheflowcytometicmethodrangingfrom 3 000 to150 000/μL.
小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西 于正强 胡东 李林蔚 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
基本信息中文名称:流式细胞术外文名称:Flow Cytometry, FCM优点:速度快、精度高、准确性好等作用快速测定细胞或细胞器生物学性质特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量最高速度:每秒钟3万个细胞4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。
在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。
而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。
CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。
CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。
六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。
待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。
七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。
八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。
2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。
3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。
九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。
2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T 淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
1. 1 主要试剂和仪器 CFSE 购自 Molecular Probes 公司; 植物血凝素( PHA) 购自 Sigma 公司; CD3 mAb ( OK3) 为美国宾夕法尼亚大学 Carding 博士惠赠; 结 核杆 菌低 分 子 多 肽 抗原 ( Mtb Ag ) 由 本 室 根 据 文 献[ 3, 4] 自制。RPMI 1640 培养液( GIBCO 公司) 补充 2 mmol/ L L 谷氨酰胺、50 mol/ L 二巯基乙醇( 2 ME) 、 1 mmol/ L丙酮酸钠、50 mg/ L 庆大霉 素 和 100 mL/ L 新生 小 牛血 清( NBS, 杭 州 四季 青公 司) 后 为 完 全
[ Key words] Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Proliferation; T cell subpopulations; Flow cytometry
检测淋巴细胞激活后的增殖反应是免疫学实验 研究中的基本技术, 传统方法有同位素( 3H TdR) 掺 入法和形态学方法, 也有用 MTT 法, 以及 BrdU 标记 法等技术。这些检测方法均不能反映不同淋巴细胞 亚群的增殖状态。1990 年, Weston 等用活细胞染料 羧基 荧光 素 乙 酰乙 酸 琥 珀酰 亚 胺 酯 ( Carboxyfluo rescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE ) , 也 常 简称为 CFSE, 标记淋巴细胞研究迁移活动[ 1] 。随后 Lyons 等[ 2] 用其检测淋巴细胞的增殖反应。CFSE 是 非极性分子, 可自由扩散进入细胞, 在胞内酯酶水解 后产生具有荧光特性的 CFSE, 并与胞内蛋白的赖氨 酸等胺基发生不可逆偶联, 形成稳定的大分子荧光
流式细胞仪操作规程目录_百替生物
流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定(C D系列)HLA-B27测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：HLA-B27测定CD55/CD59测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：CD55/CD59测定血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共2页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：血小板膜表面抗体测定红细胞抗体测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共2页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）粒细胞抗体测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共2页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：粒细胞抗体测定白血病免疫分型测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：白血病免疫分型测定T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测service@ 细胞周期检测1. 细胞制备和染色:--收获细胞并PBS 洗涤,10*4-6个,染色过程之前要经过100-300目滤网过滤,离心弃上清待用;--使用BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒(LPR:打孔\固定\溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入LPR 100 ul,室温避光20 MIN,再加入DNA STAIN 1000 ul,室温避光20 MIN,上机检测.--使用酒精固定和PI: 上述细胞内加入70%预冷酒精,4 C 过夜; 离心弃上清后加入PI 工作液室温避光30MIN.2. 从PROTOCOL 中找出DNA CONTENTS。
流式检测T细胞亚群 ppt课件
▪ 带通滤片 BP：允许相当窄的一段波 长范围内的光通过
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(三)信号检测与分析系统
▪ 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射，受激光激发，产生代表不同物 质的不同波长荧光信号。这些信号以细胞为中心向空间360度立体角发射， 产生散射光和荧光信号。
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散射光信号：
▪ 散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角 散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制 备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有 参数。
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▪ 双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参 数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dot plot)、等高线 图(contour plot)、二维密度图(density plot)。在二维图中，x坐标为 某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值。从双参数 图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。
55%
5%
25%
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精度。
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▪ 流动室内充满了鞘液，鞘液的作 用是将样品流环包，鞘液流是一 种稳定的液体流动，鞘液以匀速 运动流过流动室，在整个系统运 行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦， 使样品流不会脱离液流的轴线方 向，并且保证每个细胞通过激光 照射区的时间相等，从而得到准 确的细胞荧光信息。
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细胞计数
计算公式：四个角大方格细胞数的总和/4 ×104 （ml）
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细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml， 如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
流式细胞术检测肺结核患者血清T淋巴细胞亚群分析
流式细胞术检测肺结核患者血清T淋巴细胞亚群分析【摘要】目的：分析流式细胞术检测中肺结核患者血清T淋巴细胞亚群的改变。
方法：将2015年6月-2016年6月医院收治的100例肺结核患者进行流式细胞术检测，进行血标本采集，随后观察肺结核患者经过治疗后血清T淋巴细胞亚群的改变情况，并且与未患病者进行比较。
结果：初至活动性肺结核患者血清中CD4+、CD4+/CD8+降低，而CD3+、CD8+升高，与正常对照组相比，CD8+、CD4+/ CD8+差异有显著性（P <0. 05）；病变范围广泛者的CD3+、CD4、CD4+/CD8+ 较病变范围小者低，CD3+ 差异有显著性；痰菌阳性者与阴性者比较，CD4+/CD8+ 下降，CD8+升高，但差异无显著性（P >0. 05）。
结论：初治活动性肺结核患者的T 细胞亚群变化存在其自身特点。
对肺结核患者 T 淋巴细胞亚群的检测有助于判断病情、了解抗结核治疗效果。
【关建词】流式细胞术检测；肺结核；T淋巴细胞亚群肺结核是由结核杆菌感染引发的一种慢性传染性疾病，据相关资料表明，我国是高居第二位的结核病高负担国家。
肺结核早期临床表现及体征同其他相关肺疾病相似，易导致误诊或漏诊，进而使病情延误。
T淋巴细胞作为机体执行细胞免疫主要效应细胞之一，其亚群改变对肺部疾病的发生及发展具有直接影响，因此，对T淋巴细胞亚群水平予以相关检测，直接关乎到患者机体免疫功能改善、肺部疾病病情的临床诊断及治疗。
对此，现选取100例初治性肺结核患者，对其血清中T淋巴细胞亚群情况进行分析，相关结果总结并报告如下。
1 资料与方法1.1 一般资料（1）肺结核患者组：选取2015年6月-2016年6月医院收治的肺结核患者100例，其中男58例，女42例，年龄15-76岁，平均（43±2.85）岁，其中结核菌阴性56例，结核菌阳性44例。
诊断依据为：有结核中毒症状；X 线检查及CT 检查发现结核病灶，并提示结核活动；结核菌阳性者痰涂片、痰培养或气管镜刷检找到结核分枝杆菌；结核菌阴性者经诊断性抗结核治疗病灶吸收。
流式细胞术检测T细胞亚群概要
1953年 Crosland –T轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。
二）
三）流式细胞仪的工作原理
参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
流式细胞术检测T细胞亚群
组 长： 杜建呈 田 呈（讲解） 小组成员： 李 姚
罗光珍
范成芬 钱洪珍
实 验
一
1 了解流式细胞术的基本发展过程
目
2 掌握流式细胞术的基本原理及应用
的
3 掌握分选T细胞亚群的原理与方法
4 掌握T细胞亚群分选的意义
二，流式细胞术的发展史
Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 1934年 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻。
两种流式细胞仪检测T细胞亚群的比对分析
两种流式细胞仪检测T细胞亚群的比对分析流式细胞仪是一种用于研究和分析细胞的仪器。
它可以通过分析细胞的表面标记物或细胞内的分子，来获得关于细胞亚群的信息。
其中，T细胞是一类重要的免疫细胞，可以分为多个不同的亚群，如细胞毒性T细胞（CD8+）、辅助性T细胞（CD4+）等。
在免疫学研究和临床检测中，了解T细胞亚群的数量和比例对于评估免疫功能的状态至关重要。
下面将介绍两种常用的流式细胞仪检测T细胞亚群的比对分析方法。
1.全血淋巴细胞表面标记法全血淋巴细胞表面标记法是通过将新鲜全血样本进行细胞表面标记，然后使用流式细胞仪进行分析。
该方法的优点是样本处理简单快速，可以直接得到体内T细胞亚群的比例。
具体步骤如下：（1）制备淋巴细胞上清液：将新鲜全血样本与等体积的生理盐水混合，用离心管密封离心，将上清液分离出来。
（2）染色：将淋巴细胞上清液转移到离心管中，加入适量的表面标记的单克隆抗体。
常用的表面标记抗体有CD3、CD4和CD8等。
（3）洗涤：离心管密封离心，将上清液倒掉，再次加入适量的生理盐水洗涤淋巴细胞。
（4）流式细胞仪检测：将洗涤后的细胞上样到流式细胞仪中，设置相应的检测参数，如激发波长和荧光信号的检测通道。
通过流式细胞仪收集数据，并使用分析软件对数据进行解析和计算。
这种方法的优点是可以同时检测多种T细胞亚群，准确计算亚群的比例。
但是由于这种方法无法获得细胞内的功能和分子表达信息，只能通过表面标记物进行鉴定。
2.胞浆染色法胞浆染色法是通过流式细胞仪检测细胞胞浆内的标记物，从而分析T 细胞亚群的比例。
该方法通常与细胞表面标记法联合使用，可以同时获得细胞表面和胞浆内的信息。
具体步骤如下：（1）制备全血淋巴细胞上清液：与全血淋巴细胞表面标记法相同。
（2）染色：将淋巴细胞上清液进行细胞膜标记和胞浆胞浆标记。
胞浆标记常用的有抗体和荧光染料，如免疫球蛋白（IgG）等。
（3）洗涤：与全血淋巴细胞表面标记法相同。
（4）流式细胞仪检测：与全血淋巴细胞表面标记法相同，但需要在分析软件中选择相应的通道来检测胞浆标记物。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理及注意事项
流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。
在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。
其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。
**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。
通常情况下，我们会收集外周血进行检测。
在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。
2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。
我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。
这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。
3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。
在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。
4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。
**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。
通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。
2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。
还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。
3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。
【学前教育】小鼠t 细胞亚分群流式
小鼠t 细胞亚分群流式1️⃣ 引言：T细胞亚群的重要性在免疫学研究中，T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分，扮演着至关重要的角色。
它们不仅参与细胞免疫应答，还在体液免疫中发挥着调节作用。
小鼠作为生物医学研究的常用模型动物，其T细胞亚群的研究对于理解免疫机制、疾病发生发展及免疫治疗策略具有重要意义。
流式细胞术（Flow Cytometry）作为一种高效、多参数的细胞分析技术，已成为研究小鼠T细胞亚群不可或缺的工具。
2️⃣ 小鼠T细胞亚群概述小鼠T细胞主要分为两大类：CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
这两类T细胞在免疫应答中承担着不同的功能。
CD4+ T细胞主要负责辅助B细胞产生抗体，参与体液免疫，并可通过分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能。
而CD8+ T细胞则主要执行细胞毒性功能，直接杀伤被病毒感染的细胞或肿瘤细胞。
此外，根据功能的不同，CD4+ T细胞还可进一步细分为Th1、Th2、Th17和Treg等亚群，它们在免疫应答中发挥着不同的调节作用。
3️⃣ 流式细胞术在小鼠T细胞亚群分析中的应用流式细胞术通过标记细胞表面的特异性抗原或细胞内的分子，利用激光激发荧光染料发出的光信号，对细胞进行多参数、高通量的分析。
在小鼠T细胞亚群分析中，流式细胞术具有以下优势：多参数分析：可以同时检测多个细胞表面标志和细胞内分子，如CD4、CD8、CD25、Foxp3、IFNγ、IL4等，从而准确区分不同的T细胞亚群。
高通量：能够在短时间内处理大量样本，提高实验效率。
敏感性高：能够检测到极低浓度的细胞亚群，有助于发现稀有细胞类型。
功能分析：通过刺激细胞后检测细胞因子分泌等，可以进一步分析T细胞的功能状态。
在具体操作中，首先需要对小鼠的脾脏、淋巴结或外周血等组织进行细胞分离和纯化，然后使用特异性抗体对细胞进行标记。
接下来，将标记后的细胞通过流式细胞仪进行检测，根据荧光信号的强度和波长，对细胞进行分群和定量分析。
最后，利用流式细胞术软件对数据进行处理和分析，得到各T细胞亚群的比例和功能状态。
流式细胞术(FCM)简单介绍及淋巴细胞亚群结果判读-精品医学课件
EDTA抗凝样本最好不要超过24小时。使用除EDTA以外其它抗凝剂的样本，在 送检时应同时送未染色的血液涂片作形态学检测。
其它体液
CLSI H43-A2-2007
肝素钠、EDTA和ACD都可使用。用ACD过夜保存的标本的细胞可能较脆弱，活 力也较低。如果使用ACD，应使体液和抗凝剂保持合适比例，以免改变pH，从 而导致细胞活力的降低。
计数基本正常，则可明确此群细胞存在异常。
一种淋巴细胞亚群变化(相对数)
• 二一判别法：判别T、B、NK淋巴细胞亚群中哪一种是引起相对数改变的原因。
• 三种淋巴细胞中，二种百分比变化趋势一致的，另一种则是异常的根源
• 一二判别法：判别T细胞两个亚群中哪一种是引起相对数变化的原因
• 以CD3+T细胞百分比为基准，CD4+和CD8+哪种百分比变化趋势与CD3+T一致，这种T细胞亚 群则是异常的根源
• 过敏性疾病：并非所有这类患者都需要进行淋巴细胞亚群的检测。 对于一些严重的过敏患者应考虑淋巴细胞亚群的检测。
• ① 婴幼儿时期全身严重湿疹样表现 • ② 嗜酸性粒细胞显著增多 • ③ 血清IgE水平明显增高（IgE>1000IU/L） • ④ 伴有反复、严重感染的患者
Williams KW, Milner JD, Freeman AF. . Immunol Allergy Clin North Am. 2015;35(3):523-44.
本的活力，这对于新鲜组织标本尤为重要。对送检作流式细胞术分析的所有组织样本，和采集后24小 时才送达的外周血或骨髓样本都必须做活力评估。 对低活力样本的处理 CLSI H43-A2-2007 ➢ 对活力＜75%的非不可替代样本应予以拒收。 ➢ 如果是活力＜75%的不可替代样本（骨髓或组织） ，应出具一份声明以注明样本活力不佳，但必须报 告所有区分出来的异常细胞群体。 ➢ 如果未能区分异常细胞群，且活力＜75%，应考虑拒收样本并要求重新采集。
流式细胞术检测T细胞亚群
现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发 源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织 化学的基础上提出了两个新设想 1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的， 即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学 的重要信息。
2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从 而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞 可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用 作鉴别细胞的依据。
三，流式细胞术的基本原理及应用
一） 流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构
进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特 异荧光染料染色后，放入样品管。
2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成 样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向 下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕 细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆 柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直 相交相交点称为测量区。
二）
三）流式细胞仪的工作原理
参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。
流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用
【 摘要 】 目 的 探 讨胸 水 、 水 、 泡灌 洗 液 Ｔ 淋 巴 细胞 亚 群 的检 测 方 法及 临床 价 值 。方 法 采 用 流式 细 胞 术 检 测 良 、 性 腹 肺 恶 疾病患者的 ５ Ｏ例胸 水 、 ６例腹 水 、 ７例肺 泡 灌 洗 液 （ Ａ ） Ｔ淋 巴 细 胞 亚 群 的水 平 并 分 组 进 行 比较 。结 果 １ 胸 水 ： 核 性 ４ ４ Ｂ Ｉ 中 Ｆ ） 结
病 组 肺 泡灌 洗 液 Ｔｓ 胞 占 Ｔ 淋 巴细 胞 的（ ４５ ±９ ５ ） 、 ｈ细 胞 占 Ｔ 淋 巴 细 胞 的 （９ ２ ± １． ８ ％ 、 ｈ Ｔ 细 ４ ． ４ ． ６ Ｔ ４ ．８ ２ ８ ） Ｔ ／ ｓ比值 为 １ １ ± ．３
０２， ． ９ 肺部 恶性 肿 瘤 组 肺 泡灌 洗 液 Ｔｓ 细胞 【 淋 巴 细胞 的（ ５ １ ±７ ７ ） 、 Ｔ ６ ． １ ． ７ Ｔｈ细 胞 占 Ｔ 淋 巴 细 胞 的（ ４ ５ ±６ ６ ） 、 ／ ｓ ３ ． ７ ． ５ Ｔｈ Ｔ
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国际检验 医学杂志 ２１ １ 第 ３ 卷第 ｌ ００年 月 １ 期 ｌｔ ａ ｎ ＪＬｂ
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临 床 研 究
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流 式 细 胞 术 检 测 体 液 Ｔ 淋 巴细 胞 亚 群 的 临床 应 用
莫 扬 许 小 东 ，
（ 中科技 大学 同济 医学院 附属 襄樊 医院检验科 ， 北襄樊 ４ １ ２ ；． 生部北京 医院流式细胞仪 室 １ ０ ３ ） 华 湖 ４ ０ １２卫 ０ ７ ０
人和小鼠th亚群鉴定方案
人和小鼠th亚群鉴定方案
（最新版）
目录
1.引言
2.人和小鼠 th 亚群鉴定方法
3.th 亚群的分类
4.th 亚群的功能
5.应用实例
6.结论
正文
1.引言
在人类和老鼠的研究中，th 亚群的鉴定方案起着至关重要的作用。
th 亚群，全称 T helper 17 cells，是一种在免疫反应中起到关键作用的细胞亚群。
对于研究人类和老鼠的免疫系统，了解 th 亚群的鉴定方案是必不可少的。
2.人和小鼠 th 亚群鉴定方法
th 亚群的鉴定方法主要依赖于流式细胞术。
通过检测细胞表面的标志物，如 CD4、IFN-γ等，可以准确地鉴定出 th 亚群。
3.th 亚群的分类
th 亚群主要分为两类，一类是 T helper 17 cells (Th17)，另一类是 T helper 1 (Th1)。
其中，Th17 主要参与对细菌和真菌的免疫反应，而 Th1 则主要参与对病毒的免疫反应。
4.th 亚群的功能
th 亚群在免疫反应中起着关键作用。
Th17 可以产生 IL-17，这是一
种具有抗菌作用的细胞因子。
而 Th1 则可以产生 IFN-γ，这是一种具有抗病毒作用的细胞因子。
5.应用实例
th 亚群的鉴定方案在许多研究中都有应用，比如在研究免疫系统疾病、感染疾病、肿瘤等。
通过鉴定 th 亚群，可以更好地理解疾病的发生机制，从而为治疗提供新的思路。
6.结论
th 亚群的鉴定方案对于研究人类和老鼠的免疫系统有着重要的作用。
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流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
Ionomycin（Sigma）贮存液：Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中，此时为50µg/ml。
GolgiStop（内含Monensin ，BD Pharmingen）Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均购自BD Pharmingen。
抗体细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。
抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。
细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。
抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。
以上抗体均购自BD Pharmingen。
实验方法1 外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。
在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。
将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。
2000g离心20min。
取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。
弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。
2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。
24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。
加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃CO2孵箱刺激4h。
收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。
加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。
流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。
采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。
24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。
加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。
37 ℃CO2孵箱刺激8h、12h 分别收集细胞。
采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。
分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。
将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。
加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。
加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。
实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。
加入Perm/Wash 液500µl洗涤两次。
最后以300µl洗涤液重悬细胞。
采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。
以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。
最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。
分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA 和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。
将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。
调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。
以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
结果1 不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。
10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表达明显下降，已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞，而CD8和CD3的表达未受明显影响。
重复5次检测，典型的检测结果见图1。
2 不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。
PMA刺激8h后CD4阳性T 淋巴细胞的表达没有明显下降。
PMA刺激12h后，CD4阳性T淋巴细胞的表达明显下降。
而CD8表达在8h和12h均没有明显下降。
典型的检测结果见图2。
3 正常人外周血Th1细胞和Th2细胞。
采用CD3+CD8-的T淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞（IL-4+）的百分比。
典型检测结果见图3。
4 正常Balb/c小鼠外周血Th1细胞和Th2细胞。
采用CD4＋淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞的百分比（IL-4+）。
典型检测结果见图4。
讨论从Rostaing等[2]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后，陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。
虽然活化T淋巴细胞有各种各样的方法，如：PMA、PHA、Con A、CD3、CD2和CD28等。
但是目前公认的较好的方法仍然是PMA 和钙离子载体的联合刺激。
研究发现在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表达就达到一个较高的水平，因而适合进行流式检测。
我们的研究结果发现，人的外周血T淋巴细胞表面的CD4表达受PMA的影响非常大，在刺激后2h即明显下降，4h已经难于区分CD4阳性T淋巴细胞，因此这就难于确定Th细胞。
虽然国内部分学者认为在PMA的刺激下，CD4仍可以维持一定的表达[3,4]，但是我们的结果和国内部分[5]及国外的大多数[2,6]研究结果表明，在PMA的刺激下，CD4表达迅速下调，此时采用CD4来标记Th细胞已经不能准确的检测Th细胞，因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。
而CD3和CD8的表达受PMA等刺激因子的影响很小，因此，目前，国外推荐的方法是采用CD3和CD8设门，区分CD4阳性T淋巴细胞。
由于多色荧光标记流式检测技术的发展，笔者认为采用4色标记技术检测人Th细胞是目前最好的方法。
这种方法可以实现一个检测管，同时观察Th1细胞和Th2细胞；可以检测CD8＋细胞的细胞内因子的表达；还可以观察IL-4和IFN-γ双阳性细胞。
一个检测管同时染色，节约了抗体和劳动量等检测成本。
但是由于多色染色技术对流式的操作者有较高的要求，实施过程要注意补偿调节等具体问题，我们曾经采用CYC标记的CD8和APC标记的CD3联合设门区分Th细胞，由于CYC和APC在BD公司的流式细胞仪上，仪器的补偿调节非常困难，最终放弃该方法，改用PerCP标记的CD8才解决这一问题。
目前，国内一些流式细胞仪型号相对落后，不能进行4色染色标记技术，笔者认为可以采用双管标记检测法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色标记一管用于检测Th1细胞；采用CD3、CD8和IL-4 3色标记一管用于检测Th2细胞。
采用这种方法的缺陷是每个样品检测管数增加，造成检测成本增高，而且不能同时观察IL－4和IFN-γ双阳性细胞。
国外有报道采用IFN-γ、IL-4和CD3进行3色标记[7]，这种方法只能观察T 淋巴细胞表达的细胞因子的变化，不能区分CD4＋和CD8＋细胞，笔者认为是一种不可取的方法。
我们在Balb/c小鼠实验发现在PMA的刺激下，CD4表达虽然下调，但是其表达持续时间比人的持续时间明显增长，在刺激8h后，仍然能维持一个较高的水平，因而能够有效的区分Th细胞。