复合益生菌的研制及应用

℃恒温箱 中培养２ 后 ，分别取少量放 于平 皿上 ，格兰氏染色 度离心 ８ ｉ，取沉淀物拌 于饲料 中饲 喂。 ４ｈ ｎ ａ ｒ
１ ２ ３ 复 合 益生 菌的培 养 ．．
１ ３ 实验动物机体免疫状 况检 测 ． 在 确 定４ 菌 存 活及 生 长 良好 １ ３ １ 玫 瑰 花 环 形 成 试 验 种 ．．
ｋ ｇ）高于对照组 （ ． ４ ｇ （ ＜０ ０ ），试验组 的增重率 （ ． ６ ）比对 照组 （ ． ０ ７ ｋ ） Ｐ ． ５ ２ ７％ ２ ２％）升 高０ ５ ％ ０ ． ６ 。试验组 断奶 仔兔血液 中
Ｔ 巴细胞 的玫瑰花环 形成率在 ８ ． Ｏ ，远 高于对照组 的玫瑰花 环形成率 ６ ． ６ 。试验 组断奶仔兔血 液循环 中Ｔ 巴细胞数 目 淋 ５１％ ９ ０％ 淋 （ ９ 个 ）比对 照组 （ ２ 个 ）高出２ ． ７ 试验 组兔体 内抗 大肠杆 菌抗体 比对 照组 高出４ ０ 。 由以上结果可 知在 断奶仔兔 的 ３ ７ ３９ ６％ ０ ０倍
衣 芽孢 杆菌菌 种来 自于河 南科技 大学 动物科 技学院 微生物 实 体培养基让其饮水 。 验 室 。先分别 将ｉ 种菌接 种于 ＭＲ 液体 培养基 复活 ，置于 ３ Ｓ ７
镜 检 ，观察细菌 的活性 、形态及是否有杂菌 。
拌料饲喂 ： 将增 菌的Ｍ Ｓ 体培养基 以３０转 ／ ｉ的速 Ｒ液 ００ ｍｎ
以上淋 巴细胞 ，计算 出花环细胞 占淋 巴细胞 的百分 比。
花环率：— — — ×ｌ ｏ Ｏ％ 玫瑰花环形成细胞数＋ 未形成玫瑰花环细胞数
加 蒸馏水 至５ ０ｍ 充分 混合 ，以９ １ ｎ ０ ｌ 磅 ０ｍｉ高压 灭菌 。用前用 １ ３ ２ 酯酶 染 色 法 ．．
５ ％的碳酸氢钠溶液ｐ 值于７０ Ｈ ．。
１ ２ １ １ 产 芽孢 菌的筛选 ．．．
１ ２ ７ １ 实验动物分组 ．． ． １ ２ ７ ２ 饲 养 管理 ．． ．
选 择 日龄 ，体 重相近的断奶 肉仔 兔
共３ 只 ，随机２ （ ０ 组 不分公 母 ），对照组ｌ 只 ，试验组２ 只。 Ｏ Ｏ 试验 兔室 内笼 养 ，兔笼为 单个 式 。每
冰箱备用。 ⑦ 细胞营养液的配制Байду номын сангаас： 入 双抗０３ｍ ，用５ ． ｌ ％的碳酸氧钠溶液调ｐ Ｈ值至７ 。 ． ０
乙液 ：磷酸氢二钾２ ． ，加 蒸馏水 至１０ 。 ３８ ｇ ８ ００ ｍｌ 取 甲液 １ ，乙液８ ，混合后 即成 。 ３ ｍｌ ７ ｍｌ （ 酯 酶染色 液 的配 制 ：吸取 副 品红 液３ｍｌ ５ ） 于瓶 中 ，再 吸 取４ ％亚 硝酸钠 溶 液３ｍｌ ，徐徐 加入Ｍ／ ５ｐ ．磷 酸盐 缓 冲 １ Ｈ ７６
日 中添加 复合 益生菌能够显著 的提 高生产性能 、增强机体免 疫力，对促进生长 、降低料 肉比、提 高饲料利用率等指标 有较 好 粮
的 效 果
［ 关键词］ 复合 益生菌 断奶仔 兔
免疫力 日增重
饲料利用率
１ 材 料与方法
１ １ 材 料 ． １ １ １ 培 养基 ．．
括 ：Ｖ— 测 定 、接 触 酶 反 应 、水 解 反 应 、糖 发 酵 实验 、硝 Ｐ 酸盐还 原 、吲哚 反应 、柠檬 酸反 应等 。
灭菌 ，保存 于４℃冰箱 。
称取 枸橼 酸纳 １ ，溶 于蒸 馏水５ ，１磅 １ ｉ高压 甲醚１０ｍｌ ．ｇ ９ ０ｍｌ ０ ０ｍ ｎ ０ ，放有色试剂瓶 中，置４ｏ冰箱 中保存备用。 Ｃ
⑥红细胞保存液 （ 氏液 ）的配制 ： 阿 称取 葡萄糖２４ ，２ 合柠檬 酸钠０９ ，氯化钠０５ ４ ．６ｇ 水 ．６ｇ ． ０ ｇ ，蒸馏水 １ ０ｍｌ ０ ，各成分在蒸馏水 中溶解 后 ，加入５ ％柠 檬酸 钠约 １ ，渊ｐ 值 于６１ ０ １ ｉ高压灭菌 ，保存 于４℃ ２ｍ１ Ｈ ．，１磅 ０ｍ ｎ
过滤 。
取水 剂 青 霉 素 １ ０ 单位 ，链 霉 素 １０ｇ，溶 于 １ ０ ｍｌ ０万 ． ０
Ｈ ｎｓ ａ ｋ液中 ，低温冰箱保存 备用 。
④５ ％的碳 酸氢钠 溶液配制 ：
称取 碳酸氢钠 ５ｇ ，溶 于１ ０ｍｌ ０ 蒸馏水 中 ，瓶 口用胶塞塞
（）．％的亚硝酸钠溶液 ：４ ２１ ６ ％的亚硝酸钠１ ，加蒸馏水２５ ｇ ． ｍｌ ，临用当天配制。
在无菌条件下 ，取５ｇ 枯草加入到 笼 面积０３ （ ． ． ），对 照组笼 中１只 ，试 验组笼 中２ ． ｍ ０５×０７ ５ ０ ０
盛有４ ｌ ５ｍ 无菌 生理盐水 的ｉ角瓶 中 ，振荡混 匀 ，悬浮液 于８ 只。兔舍 自然通 风 ，每 天定 时打扫卫 生和清 理粪便 一次 ，碗 ０
① Ｈ ｎｓ ： ａｋ液
．．． 后 ，分 别将其接种 于ＭＲ 固体 培养基上 ，置于３ 恒温 箱 中 １ ３ １ １ 试 剂 配 制 Ｓ ７
培 养２ 后 ，观察菌落形态及是否有杂菌生 长。之后 ，分别将 ４ｈ 其 接种 于ＭＲ 液体培养基 中增 菌培养。 Ｓ
原液 甲 ：氯化 钠 １０ ，氯化 钾８ ， ７合硫酸镁 ２ ６． ｇ ０ ． ｇ ７ｋ ０ ． ０ １２４ 复合 益生 菌的鉴定 对４ 菌 先进 行形 态 观察 ，之 后 ｇ ７ ．． 种 ，６ｋ合氯 化镁 ２ ，溶于８ ０ｍ 双蒸馏水 中；氯化钙２０ｇ ．ｇ ０ ０ ｌ ． ， 进 行 染 色 特性 ，菌 落 特性 鉴 定 ，最 后 通 过生 化 反应 结 果 并 溶 于１０ｍｌ ０ 双蒸馏水 中 。将上述 ２ 混合后 ，加蒸 馏水至 １Ｏ 液 Ｏ０ 依 据 《 见 细菌 系统 鉴定 手 册 》来 确 定 细菌 。生 化反 应 包 ｍ ， 常 ｌ 用滤纸过滤 ， 加入２ ｍ氯仿作 为防腐 剂 ， ． ｌ Ｏ 保存 于４℃。
１ ３ ２ １ 试 剂配 制 ．．．
②０５ ． ％的乳 白蛋 白水解物的配制 （ 乳汉液 ）：
称 １ｇ 白蛋 白水 解物 ，溶 于２ ０ ｍ ｎ ｓ 中，９ １ 乳 ０ ｌ Ｈａ ｋ液 磅 ０
① 同定液 ： （ 福尔马林 一丙酮酸缓冲液 ）
磷酸氢二钠２ ｇ ０ｍ ，磷 酸二氢钾 １０ｍ ，双蒸馏水３ ｌ ０ ｇ ０ｍ ，
饲料及饲料添加剂
中国畜牧兽 医文摘 ２ １年 ０ １
２卷 ７
第３ 期
复合益生 菌 的研 制及应 用
杨 智敏 刘爱玲 赵风琴
４ １２ ） ７ ０ ２ （ 河南省洛 阳市洛龙 区动物 疫病预 防控制中心 ，洛阳
［ 摘 要］ 选择 ３ 只５ 龄 、体 重在 ０ ５ ． ５ ｇ４ ０ ０ｌ Ｅ ． ～０ ７ ｋ ６ 断奶 肉仔 兔，设 １ Ｊ 个试验组 ，１ 个对照组 ，完全 随机 分组，试验 期为６ ０ ｄ 。试验组基础 目粮 中添加一定 剂量 本 实验 室培 养的复合益 生茵，对照组按 常规 方法饲 养 ，测定 日增 重、增重率 、 日耗 料 、料 肉比及机体免 疫状况等指 标。试验期 结束 ，对试验 兔心脏采血 ，以玫瑰花环 试验检 测兔血 液中Ｔ 巴细胞 的玫瑰花 环形成率 和 淋 酯酶染 色试验检测血 液中 Ｔ淋 巴细胞 的数 目。以试管凝集反应检 测大肠 杆菌抗体含量 。试验 结果表 明：试验组平均增重 （ ． １ １ ０
ａ 高压灭 菌 ，保存 于４ｏ冰箱备用 。 ｒｎ ｉ Ｃ
③抗 菌素配制 （ 简称ｓ 液或双抗 液 ）： Ｐ
丙 酮４ ，４ ％的 甲醛２ ｌ ０ｍｌ ０ ５ｍ ，充分混 匀后 溶解过滤 ，置４℃ 冰箱备用 。
②染色液 （） １ 染色液副 品红溶液 ：副品红４ｇ Ｉ Ｎ ￣ 人２ 盐酸１ ０ｍｌ Ｊ Ｊ ０ 溶解
蛋 白胨 ，酵母浸膏 ，Ｎ Ｃ ，牛肉提取物 ，葡 １ ２ ５ 复合益 生菌的增 菌 将 培养好的复合 益生菌用ＭＲ 液 ａ１ ． ． Ｓ １ ２ ６ 饲粮 配方 ．． 试验 所用 的基础 日粮 配 方 ：豆柏 ，菜 籽
萄糖 ，乙酸 钠 ，柠檬 酸二胺 ，吐温 一 ０ ８ ，磷酸氧二钾 ，七水硫 体培养基增菌 。
（）％ ａ 醋酸萘酯溶液 ：称取ａ 醋酸萘酯２ ，加入 乙二醇 ３２ 一 一 ｇ （） １ Ｈ７ 磷酸盐缓 冲液 ： ４Ｍ／５ｐ ． ６ 甲液 ：磷酸二氢钾９０ ，加蒸馏水至 １０ ｌ ． ｇ ８ ０ ０ｍ 。
紧 ，防止漏气 ，ｌ磅 １ ｉ高压灭菌 ，保存于４℃冰箱备用 。 ０ ０ｒｎ ａ ⑤３８ ．％枸橼酸纳溶液 的配制 ：
・ｌ ０・ ７
中国畜牧兽医文摘 ２ １￣ ２ 卷 第３ ０ １ ７ 期
饲料及饲料添加剂
个 ０ 个 原液 乙：１水合磷 酸氧二钠３ ４ｇ ２ ． ，磷酸二氢钾 １ ，葡 粘贴 ４ 以上 的绵羊 红细胞 为 阳性 花环形成 细胞 ，检查３ ０ ０ ．ｇ ２
萄糖２ ．ｇ 于８ ０ｍ 双蒸馏水 中 ；称 取０４ｇ ００ 溶 ０ ｌ ． 苯酚红于研钵中 ， 渐渐加入０１ 氧氧化钠并不断研磨 ，直至所有颗粒 完全溶 解 ， ．Ｎ 所加入氢氧化钠的量为 １．８ ，最后加蒸馏水至 １０ｍ 。 ２ １ ｍｌ ０ ｌ 将 上述２ 液混合 ，加 双蒸馏水 至１０ ０ｍ 用 滤纸过滤 ，加 ０ ｌ 氯 仿２ ，保存４℃冰箱 。使用时 ，取 原液 甲、乙各２ ， ． ｍｌ ０ ５ｍｌ
级蛋 氨酸 ，赖 氨酸 ，饲 料级 维生 素 （ Ａ、ＶＤ Ｖ Ｖ Ｅ、ＶＫ 、
ＶＣ 、 Ｖ Ｂ： Ｖ ： Ｂ．），氯 化胆 碱等 。复合 益生菌 内含有 ４ 种益 生
、
１ １ ４ 主要 仪 器设备 ．．
电热恒 温 培养箱 ；超净 工作 台 ；高 菌包括 植物 乳杆 菌 、戊糖 片球菌 、地衣 芽孢杆 菌和枯 草芽孢
出ｌ 株产芽孢 菌 ，３ ７℃下 培养 ２ ，通 过格兰 氏染色 、镜 检对 １ ２ ７ ４ 饲 喂方法 ０ｈ ．．． 试验组兔 子基础 日粮 与对照组相 同 ，在
其进行初 步鉴定。
１ ２ ２ 其他 菌的分 离与鉴 定 ．． 植物乳杆菌 、戊 糖片球菌 、地
饲喂复合益生菌时我们采取 了以下方法 ： 饮水饲 喂 ：控 制好细菌 的饲喂 量 ，直 接用增 菌的ＭＲＳ 液
酸镁 ，一水硫酸锰 ，碳 酸钙 ，琼脂 。 １ １ ２ 染 色液 ． ． 液 、９ ％酒精 、碱性 美兰。 ５ １ １ ３ 生化反应管 ．． 均购 自杭州微生 物试 剂有 限公 司。 革 兰 氏染色液 ：草酸铵 结 晶紫 染色液 、碘 柏 ，棉 籽柏 ，鱼 粉 ，草 粉 ，饲料 级磷 酸 氧 钙 ，食 盐 ，饲料
１ ２ ７ 饲 喂 方 法 ．．
压 蒸汽 消毒 器 ；电动离心 机 ；光 学显微 镜 ；电子天 平 ；接 种 杆菌 ，有效 的菌 群数保证 ＞０ １亿个， 右 。 ｇ 左 环 ；试管 ；平皿 ；冰箱等 。 １ １ ５ 实验动物 ． ． 家兔 ３ 只购于洛阳市 白马寺。 ０ １ ２ 方 法 ． １ ２ １ 枯 草芽孢杆菌的分 离与鉴定 ．．
℃下保持 １ ｎ ０ｍｉ ，以杀死非芽孢 的菌体 。取５ｍＩ 浮液接入到 式 饮水器 ，料槽 ， 自由饮水 和 自由采 食颗粒 饲料 （ 悬 计量 ）。 装有４ 种子培养基 的三角瓶 内 ，于３ ５ｍ１ ７℃富集 培养２ 。取 试 验前 按常规疫 苗程序 进行 免疫 ，试 验期 间每７ ０ｈ 天称 １ 次体重 富集 培养后 的菌 液 ，用 无菌 生理盐 水适 当稀释 ，取一定 量涂 （ 空腹 ），最后计算 日增 重率和饲 料消化率等指标。 ． ．． 布于平板 ，在３ ℃下培养２ 。挑选生长 良好 、菌落较大 的单 １ ２ ７ ３ 测 定项 目及分析 方法 试 验始 、末重 ，实验期 间每 ７ ０ ｈ 菌落接种 于斜 面保 藏培养基中 ，冰箱４℃保 藏。 周称 １ 次体重 ，每 天记 录净采食量 ，观察记 录兔 群腹泻发病 ， １ ２ １ ２ 产 芽孢 菌的初 步鉴定 样品经过上述 处理后 ，筛 选 死 情况。使用Ｅ ｃｌ ．．． ｘｅ处理文章重出现的数据。