石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

防有机磷神经毒剂中毒的乙酰胆碱酯酶抑制率。结论 石杉碱甲为可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，可以通过
血脑屏障，可能对有机磷类神经毒剂中毒具有预防作用。
【关键词】石杉碱甲；神经毒剂；乙酰胆碱酯酶
［中图分类号］Ｒ １１４
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１０００一７１６４（２００８）０１一００２４一０４
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｏｎ ＡｃｔｉＶｉｔｙ ｏｆ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ｌ，ＡＮＧ ＹｋＰ—ｚｉ７ｚ。，Ｔ工ＡＮ Ｈ“ｉ—Ｚ砌，ＳＨｆ Ｘ幻ｉ咒，ＳＵＮ Ｎ口咒一ｍｉ咒，Ｗ－ＡＮＧ Ｑ如咒ｇ
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染毒后时间（ｈ） 圈３石杉碱甲抑制大鼠全血 乙酰胆碱酯酶活性的时间一效应曲线
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＼石杉碱甲在短时间内即可对大鼠脑组织的乙酰 胆碱船酶活性产生抑制，对前皮质、小脑和海马的 抑制在ｏ．５～１ ｈ即可达到最高峰，小脑与海马酶的 活力恢复得较快，２ ｈ后即开始有不同程度的恢复， ８ ｈ后基本恢复正常（Ｐ＞ｏ．０５）。对前皮质乙酰胆碱 酯酶活性抑制时间较长，可以维持８ ｈ以上，２４ ｈ后 酶的活力基本恢复正常（Ｐ＞ｏ．０５），结果见图４。 ２．３石杉碱甲对乙酰胆碱能中毒症状的影响
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工业卫生与职业病２００８年第３４卷第１期
前皮质 小脑 海马
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石杉碱甲（ｍｇ／ｋｇ）
田２石杉碱甲抑制大鼠脑内
乙酰胆碱酯酶活性的剂量一效应瞌线
２．２石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的时间一效 应关系
石杉碱甲口服后吸收迅速，Ｏ．５ ｈ后即可达到 抑制全血乙酰胆碱酯酶活性的最高峰（１８．１３％）， Ｏ．５ ｈ组与ｌ ｈ组相比无统计学意义（Ｐ＞０．０５）； ０．５ ｈ组及１ ｈ组与对照组相比有统计学意义 （户＜ｏ．０５）。２ ｈ后酶的抑制开始下降，但仍可以 维持８ ｈ左右，２４ ｈ后酶的活力基本恢复 （Ｐ＞Ｏ．０５），结果见图３。
万方数据
抑制的剂量一效应曲线和时间一效应曲线。 １．３．３不自主运动（ＩＭ）及流涎、流泪、排尿、排 便（ＳＬＵＤ）评分依据Ｍｏｓｅｒ等的胆碱能中毒的功 能指标评分方法评分［３］。ＩＭ评分：２一正常、３一 轻微震颤、４～全身震颤、５一肌痉挛反射、６一阵 挛性惊厥；ＳＬＵＤ评分：１一正常、２一轻微、３一 中度、４一重度。剂量一效应分析于染毒后１ ｈ处死 前对ＩＭ及ＳＬＵＤ等胆碱能中毒症状评分并记录。 时间一效应分析分别于染毒后ｏ．５，１．ｏ，２．ｏ， ４．ｏ，８．Ｏ，１２．０，２４．０ ｈ对ＩＭ及ＳＬＵＤ等胆碱能 中毒症状评分并记录。 １．４统计学处理
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ； Ｎｅｒｖｅ ｉＩ堪ｏｘｉｃａｎｔ； Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ
有机磷类神经性毒剂是不可逆的乙酰胆碱酯酶 抑制剂，毒性高，不易觉察，即是恐怖活动和化学 战中最可能使用的毒剂，更是国内外防化医学研究 的重点，但目前国际上并无理想的预防用药。石杉 碱甲（ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ）是从中草药蛇足石杉中分离得 到的天然产物，其化学名为（５ Ｒ，９ Ｒ，１１ Ｅ）一５ ～氨基一ｌｌ一亚乙基一５，６，９，１０一四氢一７～甲 基一５，９一亚甲基环辛四烯并（ｂ）吡啶一２（１ Ｈ）
（’Ｓｕｚｈｏｕ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ８乙Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｕｚｈｏｕ ２１５００４ Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔ隋ｃｔ】ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｎｅｒｖｅ ｉｎｔｏｘｉｃａｎｔ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｏ．２，Ｏ．５，Ｏ．７，１．Ｏ，１．５，２．Ｏ，３．Ｏ，５．Ｏ ａｎｄ １０．Ｏ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ， ｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ， ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ， ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｉｎ ｒａｔｓ． ２．Ｏ ｍｇ／ｋｇ ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｔｉｍｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｒａｔ ａｃｅｔｙＩｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ｏ．５， １， ２， ４， ８， １２ ａｎｄ ２４ ｈｏｕｒｓ ｅｘｐｏｓｕｒｅ． ＲｅｓｕＩｔｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｆｔｅｒ Ｏ．５ ｈｏｕｒ ａｎｄ ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｔｏ ｎＤｒｍａｌ ａｆｔｅｒ ２４ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｏ．５＾√３．０ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｗａｓ ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｎｅｒＶｅ ｉｎｔｏｘｉｃａｎｔ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ ｉｓ ａ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｒｅａｋ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ， ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｎｅｒｖｅ ｉｎｔｏｘｉｃａｎｔ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．
数据录入Ｅｘｃｅｌ工作表中，用ＳＰＳＳ １３．ｏ统计 软件分析。ＩＭ及ＳＬＵＤ以中位数±四分位间距表 示［４］，乙酰胆碱酯酶含量以ｚ±ｓ表示。处理组与对 照组的结果比较用单因素方差分析，两两比较用 Ｄｕｎｎｅｔｔ一￡检验。
２ 结果 ２。１石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的剂量一效
应关系 由图ｌ可见，１．５，２．ｏ，３．０ ｍｇ／妇剂量对大 鼠全血乙酰胆碱酯酶的抑制率在２０％左右，分别 为１７．３８％，１８．５７％，２２．７５％。
低剂量的石杉碱甲对大鼠的ＳＬＵＤ症状（流 涎、流泪、排尿、排便）无明显影响，仅在１０ ｍｇ／ｋｇ 组有轻微症状，ＳＬＵＤ评分为２士ｏ．ｏｏ，与对照组 比较有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。自１．５ ｍｇ／ｋｇ开始 可见对ＩＭ症状（不自主运动）有影响，症状出现较
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石杉碱甲（ｎ培／ｋｇ）
图１ 石杉碱甲抑制大鼠全血 乙酰胆碱酯酶活性的剂量一效应曲线
石杉碱甲可以穿透血脑屏障，对脑内前皮质、 小脑、海马的乙酰胆碱酯酶活性均有不同程度的抑 制，其中对前皮质的抑制作用强于小脑及海马。 １．ｏ，１．５，２．ｏ，３．ｏ ｍｇ／ｋｇ石杉碱甲对乙酰胆碱 酯酶的抑制率达到２０％以上，结果如图２所示。
［基金项目］鎏学发 蒌展 童基 童金蒌（急ＥＥ签ｌ２翌６５兰１２熙）。究基金（ｓｚｌ２６５１０），苏州大学医 ｝［堡通翥讯簋作坌者ｊ］尝田鐾海妻林‘，酱副鹜教＝授’，煮硕．士，生蘩导吉师慧。究生，主管医师。
万方数据
酮［１］，是一种乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）的可逆性抑制 剂，可能对神经性毒剂引起的中毒具有较好的预防 作用。关于石杉碱甲毒性的研究资料很少，且对乙 酰胆碱酯酶活性抑制的特点不太明了。本研究旨在 针对石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的基本特点， 为研究石杉碱甲预防有机磷神经毒剂中毒提供基础 资料及为寻找最佳预防剂量提供依据。
石杉碱甲，浙江万邦药业公司产品，批号 ０５０５０３，纯度９９．４％；碘化硫代乙酶胆碱 （ＡＳＣｈ）、５，５一联硫代一双一２一硝基苯甲酸 （ＤＴＮＢ）、柳酸毒扁豆碱、还原型谷胱甘肽购自 Ｓｉｇｍａ公司；其它试剂为国产分析纯；双缩脲试剂 为南京建成生物公司产品。仪器：７２３型可见分光 光度计（上海菁华仪器有限公司）、电热恒温水浴 箱、低温冰箱、ＩＫＡＴｌｏＢａｓｉｃ匀浆机、高速离心 机、十万分之一分析天平（日本岛津公司）。 １．３方法 １．３．１动物分组及处理 将６０只大鼠随机分成 １０组，每组６只，染毒组每组分别以０．２，Ｏ．５， ｏ．７，１．ｏ，１．５，２．ｏ，３．ｏ，５．ｏ，１０．Ｏ ｍｇ／ｋｇ剂 量（石杉碱甲溶于生理盐水中）给大鼠灌胃，灌胃量 为５ ｍｌ／ｋｇ。对照组灌以等量的生理盐水。灌胃后 １ ｈ断头处死，收集全血于加入肝素的１．５ ｍｌ离心 管中，反复倒转充分混匀；取出大鼠脑，分离前皮 质、小脑、海马，以上操作均在冰浴中进行［２］。所 有脑组织均保存于一２０℃冷冻冰箱内待用；另将 ４８只大鼠随机分为８组，每组６只，选择合适的 石杉碱甲剂量（２ ｍｇ／ｋｇ）给处理组灌胃染毒，对照 组灌以等量的生理盐水。分别于染毒后ｏ．５，１．ｏ， ２．Ｏ，４。Ｏ，８．Ｏ，１２．０，２４．０ ｈ断头取血、脑组织。 １．３．２测定指标 （１）全血乙酰胆碱酯酶活力的测 定：用硫代乙酰胆碱一联硫代双硝基苯甲酸（ＡＳＣｈ —ＤＴＮＢ）法测定全血乙酰胆碱酯酶活力，以每毫 升血样在３７℃温浴６ ｍｉｎ，水解１微克分子基质为 １个活力单位。求得不同剂量的石杉碱甲对全血乙 酰胆碱酯酶的抑制率，绘制剂量一效应曲线。求得 不同时间点石杉碱甲对全血乙酰胆碱酯酶的抑制 率，绘制时间一效应曲线。（２）脑组织乙酰胆碱酯 酶活力的测定：准确称取脑组织，按１：９的重量 比例加生理盐水，２０ ５００ ｒ／ｍｉｎ匀浆３０ ｓ，以上操 作均在ｏ℃进行。取１２“ｌ匀浆液，ＡＳＣｈ—ＤＴＮＢ法 测定乙酰胆碱酯酶的活性。匀浆液２０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ取上清液，双缩脲法测蛋白。酶的活力单位 为每毫克蛋白在３７℃温浴６ ｍｉｎ，水解１微克分子 基质为１个活力单位，求得不同剂量、不同时间的 石杉碱甲对前皮质、小脑、海马乙酰胆碱酯酶活力
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工业卫生与职业病 ２００８年第３４卷第１期 Ｉｎｄ Ｈｌｔｈ ８Ｌ ０ｃｃｕｐ Ｄｉｓ ２００８，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１
【专题研究】 石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
杨跃新１，田海林２， 时锡金２，孙难民２，王强２ （１．苏州市疾病预防控制中心，江苏苏州２１５００４； ２．苏州大学放射医学与公共卫生学院，江苏苏州２１５１２３）
１材料与方法
１…．１ …动…物
成 一年…雄～性…ｓＤ大 一鼠７…，体”重”（２…０４． …７…±１。９．…８）。ｇ，…苏
杨跃新，等．石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
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州大学实验动物中心提供。动物饲养于具有温度控 制的房间内，室温（２３±１）℃，１２ ｈ照明（７：ｏＯ～ １９：ｏｏ）与１２ ｈ黑暗（１９：ｏｏ～７：００）交替进行，全 价营养饲料喂养，自由饮水与取食。实验前饲养１ 周以适应环境。 １．２主要试剂及仪器
【摘要】目的研究石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的基本特点，为将石杉碱甲用于预防有机磷神经毒
剂中毒提供依据。方法 以浓度为ｏ，ｏ．２，ｏ．５，ｏ．７，１。ｏ，１．５，２。ｏ，３．ｏ，ｓ。ｏ，１０．ｏ ｍ∥ｋｇ的石杉碱
甲给大鼠灌胃染毒，求得石杉碱甲对大鼠全血、前皮质、小脑、海马乙酰胆碱酯酶活性抑制的剂量一效应
曲线；以２ ｍｇ／ｋｇ的石杉碱甲给大鼠灌胃，分别于染毒后ｏ．５，１，２，４，８，１２，２４ ｈ测定乙酰胆碱酯酶活
力，求得乙酰胆碱酯酶抑制的时间一效应曲线。结果 染毒３０ ｍｉｎ后乙酰胆碱酯酶活性抑制达到高峰，
２４ ｈ后全血及脑组织乙酰胆碱酯酶活力基本恢复正常＝『一ｏ．５～３．ｏ ｍｇ／ｋｇ石杉碱甲染毒后可获得较合适的预