抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取

一、试剂配置

1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;

2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；

3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；

实际配制：

PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),

悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;

80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）

二、提取步骤

1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）

2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）

3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；

4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；

5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。

6、2000g 1min;

7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做)

8、用Percol试剂进行梯度离心（将3ml含有80%Percol（原液按100%算）铺在10ml离心管下层，再把3ml 40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g 2-3min（用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol

之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;

9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1；（计算：取叶绿体悬浮液0.1ml，加4.9 ml 80%的丙酮，摇匀后于1000g离心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式计算：OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml）

10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%；

参考：Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.

取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：

1、用50mM PBS（保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX；

2、用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定H2O2；（本试验中用0.2 mol/L HClO4稀释）

3、用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA；

4、用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素；

抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

（上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上层，避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml