生物化学--实验七邻甲苯胺法测定血糖

生物化学--实验七邻甲苯胺法测定血糖实验七邻甲苯胺法测定血糖

【目的要求】

1.掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。

2.熟悉邻甲苯胺血糖测定法的影响因素及控制方法。

3.了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。

【实验原理】

血清样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺(Schiff硷)。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。邻甲苯胺法测得正常空腹血糖值为3.9,5.6mmol / L (70,100mg %)。

CHOH——CHOH HC——CH 酸中? CHOH CHOH—CHO C C—CHO

HOHC 2HOHC O 2 HO 2 己醛糖羟甲基糠醛

CH3 CH 3

HC———CH

HN— 2 C C—CH ,N—

HOHC O 2

邻甲苯胺醛亚胺(兰色) 【实验准备】

一、器材

1. 721型分光光度计、沸水浴。

2. 5×15cm试管、刻度吸量管。

二、试剂

1.邻甲苯胺试剂称取硫脲(AR)级

2.5g,溶于750ml冰醋酸(AR级)中，将此溶

液转移入1L容量瓶内，加入刚蒸馏过的邻甲苯胺150ml，2.4, 硼酸溶液100ml及冰醋酸至1000ml刻度，置棕色瓶中至少可用两个月。

2.葡萄糖标准储存液(10 mg / ml) 用0.25,苯甲酸溶液配制。

3.葡萄糖标准应用液(1mg / ml) 取贮存液10ml放入100ml容量瓶中，用0.25,苯甲酸溶液稀释至100ml。

【实验操作】

1.采得待测血样(抗凝)后立即离心以分离血浆(3,000转离心15分钟)。

2.取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。

邻甲苯胺法测血糖操作表

管别测定管标准管空白管试剂(ml)

血清(浆) 0.20ml ?? ??

葡萄糖标准液 ?? 0.20ml ??

蒸馏水 ?? ?? 0.20ml

邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml 3.混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。 4.以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。

5.计算

测定管吸光度 100/0.2血糖mg%,× 葡萄糖标准液值× 标准管吸光度

【注意事项】

1.本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反

应。故测定值较Folin-吴宪法为低。

2.显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。

3.温度

对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。 4.显色后颜色不稳定，室

温每放置1分钟，颜色降低0.15,。 5.邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，使用不当容易损坏比色仪器。 6.邻甲苯胺是致癌剂，测定过程中应小心使用。

【思考题】

1.试讨论血糖测定的临床意义及应用。

2.哪些因素影响邻甲苯胺法测定血糖的显色反应,操作过程中如何减少这些因素对测

定结果的影响,