基因转化方法与转基因植株鉴定全

• 化学药剂诱导转化
常用的化学诱导剂： 聚乙二醇(PEG) 多聚鸟氨酸(PLO) 聚乙烯醇(PVA)
PEG是一种细胞融合剂。
PEG法是最常用的化学基 因转化方法,它是将Ti质 粒与原生质体共同培养在 含有PEG和Ca2+的溶液
中，在高pH值条件下,原
生质体摄取外源DNA分 子,然后经再生获得转基 因植株。
转基因植物的鉴定
转基因植物的鉴定
1. 遗传鉴定
2.
表达鉴定
直接鉴定DNA分子是否整合 到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）
利用报告基因
3.
表型分析鉴定
Northern 杂交 Western 杂交
一、Southern blot检测
• 检测拷贝数
Southern blot
• 花粉管通道法
步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
技术特点： 直接、简便易行; 不需要组织培养的继代，从而排除了植株再生的障碍； 但转化效率较低； 适合于花器官较大的植物。 该方法可用于任何开花植物，将供体总DNA的片断，在受 体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通 道进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞。实际应用时一 般切除柱头进行涂抹，这样可减少DNA 进入胚囊的距离， 提高转化率，但会影响结实率。
基因导入方法:
三、电击法 (Gene transfer by electroporation)
优点： 不受宿主限制 操作简便 对植物细胞不产生毒性 转化效率较高，特别适于瞬间表达 缺点： 易造成原生质体的损伤 存在原生质体再生困难
• 注射法 开始用于动物卵细胞，后 来被用于植物。 用显微注射仪把外源DNA 溶液注入到子房或胚囊中， 由于子房或胚囊中产生高的 压力及卵细胞的吸收，使外 源DNA进入受精的卵细胞中， 从而获得转基因植株。对于 子房大、多胚珠的作物，可 以说是一种简便可行的转化 途径。
基因转化方法与转基因 植株鉴定
LOREM IPSUM DOLOR
遗传转化的主要方法 农杆菌介导的遗传转化 基因枪法 电击法 注射法 化学药剂诱导转化 花粉管通道法
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一、农杆菌介导的 基因导入(植物细胞)
Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium
图 3.18 转基因烟草中的 GUS 染色 fig3.18 GUS coloration of transformed tobacco
A
B
图 3.19 MxIrt1 基因在烟草原生质体中的瞬时表达 A. pBIrt-eGFP 在烟草原生质体中瞬时表达 B. pBGFP 在烟草原生质体中瞬时表达
•谢谢
技术特点： 转化拷贝数低 携带目的基因片段大 整合后外源基因结构变异小 操作简便等优点

该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核酸 分子引入受体细胞，外源基 因进入受体细胞核后整合到 染色体组，然后通过组织培 养再生出完整个体(植株)。
制作探针： ----- 根据试剂盒的要求确定DNA用量， 一般不超过100ng. ------ 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化
DNA酶切
-----不同的植物用于Southern杂交的 DNA量不同，一般每泳道的拟南芥DNA的 用量为10-25ug. -----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶 量，DNA的浓度不要过高。注意不同的酶 要求的反应温度不一样。 -----酶切后取少量样品检测酶切是否完全， 如果不完全，可加酶后继续酶切。
程序与方法：
①轰击微弹的制备 ② 基因枪轰击参数 ③受体材料 ④ 轰击样品
优点： 受体材料来源广泛 靶受体类型广泛 缩短了转基因周期、转基因植株变异率低 及通常具有正常的育性 缺点： 转化效率不高 多拷贝插入 费用较高
• 基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由 Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司 推出了商品基因枪PDS-1000系统。 • 基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样 品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下： DNA微弹的制备 DNA-微弹载体的制备 靶外植体准备 DNA微弹轰击 轰击后外植体的培养
二、 Northern blot
从植物中提取RNA 方法1. 热酚法 试剂： 提取缓冲液：
TE缓冲液饱和酚 氯仿 4MLiCl 乙醇 75%乙醇 300mM醋酸钠（pH5.2)
100mM LiCl 1%SDS 100mMTris-HCl (p8.0) 10mMEDTA
变性凝胶制备
-----电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上， DEPC处理水清洗2次。 -----灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理 水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水 浴上放置15分钟，加入5ml20xMOPS及15ml 甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。
转化步骤可简单概括为以下方面： 1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定（这 个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
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A
B
图 3.34 小金海棠茎叶中 MxIrt1 基因的 Northern 杂交
三、PCR检测转基因植株
转基因烟草的PCR鉴定
转正义基因烟草的PCR鉴定
1～9 转基因植株；10 正对照； 11 负对照
转反义基因烟草的PCR鉴定
1～5 转基因植株；6 正 对照；7 负对照
四、GUS、GFP检测
电泳用RNA样品的准备
----RNA加样缓冲液： 35ul 37%甲醛 100ul 甲酰胺 5ul 20XMOPS 20ul 10xDye 合计 160ul ----4ul RNA样品（ 4ul DEPC或甲酰胺中溶解 10-20ugRNA） ----- 加入16ul RNA加样缓冲液，混合 ----- 65oC加热10分钟 ----- 冰中放置5分钟
RNA电泳
把制作的凝胶置于电泳槽中，加1XMOPS 缓冲液 （用20XMOPS继DEPC处理水配置） 5V/cm,预电泳5-10分钟 于凝胶孔中加入热变性后的RNA样品 3-4V/cm，电泳1-2两个小时 电泳结束后，用比例尺照相
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转膜
• 10XSSPE 或10XSSC • 固定：0.05M NaOH 处理5分钟，或UV 或80oC1.5-2小时
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体再生植株并不 容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等现象。
四、花粉管通道法
• 花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的 花粉管通道（ 又叫花粉管引导组织），经珠心 通道，将外源DNA 携带入胚囊，转化受精卵或 其前后的生殖细胞（ 精子、卵子），由于它们 仍处于未形成细胞壁的类似“ 原生质体”状态， 并且正在进行活跃的DNA 复制、分离和重组， 所以很容易将外源DNA 片段整合到受体基因组 中，以达到遗传转化之目的。
DNA凝胶wenku.baidu.com泳
根据酶切后的目的片断大小，一般采用 0.7或0.8%的agarose。但当酶切后 目的片断较小时，要适当提高胶的浓 度。记住电泳时两边的泳道要加标准 分子标记。 电泳是电压不要过高， 一般为1v/cm。 最好电泳完毕后进行染色。 电泳完毕要用比例尺对胶进行照相。
转膜
一般用尼龙莫 一般实验室多采用毛细管法 转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE, 转膜时间一般为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时