转基因植物的鉴定

探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可被检测出 来。 这样，以特定的已知核苷酸序列做探针， 就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂 交探测出与其互补的序列，因而分子杂 交是进行核酸序列分析，重组子鉴定及 检测外源基因整合表达的强有力手段。
它具有灵敏性高（可检出10-12g，即1pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个 碱基对左右的同源序列）的特点，是当 前鉴定外源基因整合及表达的权威方法。 根据杂交时所用的方法，核酸分子杂交 又可分为印迹杂交、斑点（dot）杂交、 狭槽（slot）杂交和细胞原位（in situ） 杂交等。
鉴定转基因植株所涉及到的核酸分子 杂交有Southern杂交及Northern杂交。 Southern杂交是以DNA或RNA为探针， 检测DNA链，不仅可鉴定外源基因的 整合，还可初步鉴定插入的拷贝数。
PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称。 它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用， 根据检测的目的片段及一定的原则设计引物， 与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤的 数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可以 在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA 片段扩增数百万倍。
PCR检测所需的模板量仅为10ng以内， 而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增 效果，因而这一技术的出现为外源基因 整合的检测提供了便利条件，尤其是在 转化材料少又需及早检测的时候。 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现 假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。
外源基因转录水平的鉴定
基因表达分为转录及翻译两阶段，转录 是以DNA（基因）为模板生成mRNA的 过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白 质的过程，检测外源基因的表达就是检 测特异mRNA及特异蛋白质的生成。 所以基因表达检测分为两个水平：即转 录水平上对特异mRNA的检测和翻译水 平上对特异蛋白质的检测。
外源基因整合的鉴定 证明外源基因在植物染色体上整合 的最可靠的方法是DNA Southern分子杂 交，只有经过分子杂交鉴定过的植物才 可以称为转基因植物。
核酸分子杂交是指非同一分子来源但具 有互补序列（或某一区段互补）的两条 多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的 双链分子的过程。 若其中的一条链被人为标记上，该标记 可以通过某种特定方法检出，即成为所 谓的探针。
转基因植物的鉴定
进行基因转化后，外源基因是否进入植 物细胞，进入植物细胞的外源基因是否 整合到植物染色体上，整合的方式如何， 整合到染色体上的外源基因是否表达， 这一系列的问题仍需回答，只有获得充 分的证据后才可认定被检测的材料是转 基因的。
目前认为转基因植物的证据应有以下几点： ①要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）； ②转化当代要提供外源基因整合和表达的分子 生物学证据、物理数据（southern杂交， northern杂交，western杂交）与表型数据（酶 活性分析或其它）； ③提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫、 抗病等）； ④根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无性 繁殖）提供遗传证据。有性繁殖作物需有目的 基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性 繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。
转录水平上的检测主要方法是Northern 杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测 RNA链。 和Southern杂交相同，Northern杂交包括 斑点杂交和印迹杂交。
也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方 法检测外源DNA在植物体内的转录表达。 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行 反转录，然后再经PCR扩增。 PCR 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后 决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。
ELISA与经典的同位素标记为基础的液 －液抗原－抗体反应体系不同之处在于 建立了固－液抗原抗体反应体系，并采 用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反 应来检测。 由于酶的放大作用，使测定的灵敏度极 高，可检测出1pg的目的物，同时酶反 应还具有很强的特异性。
Байду номын сангаас
外源基因表达蛋白的检测
表达蛋白的检测方法有三种：①生化反 应检测法：主要通过酶反应来检测；② 免疫学检测法：通过目的蛋白（抗原） 与其抗体的特异性结合进行检测，具体 方法有Western杂交、酶联免疫吸附法 （ELISA）及免疫沉淀法；③生物学活 性的检测。
Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳分离抗原（Antigen）固定在固体 支持物上（如硝酸纤维素膜，NC膜）。 不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不 同，据此可确定特定的抗原存在与否以及相 对丰度，或者蛋白质是否遭到降解等。 蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛 血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭 非特异性位点，然后用含有放射性标记或酶 标记的特定抗体杂交，抗原-抗体结合，再通 过放射性自显影或显色观察。