番茄红素的微生物发酵法生产

扬州大学
研究生课程论文
论文题目：三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素的研究进展姓名：周玲
学号：M13824
专业：食品科学
课程老师：于海
2014年3月3日
三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素的研究进展
摘要：番茄红素是一种重要的脂溶性类胡萝卜素，具有很强的抗氧化功能及抗癌、增强免疫力、保护皮肤等生理功能，在食品、医药等领域具有广泛的应用价值。

番茄红素的来源有植物提取法、化学合成法、微生物发酵法。

相较前两种方法，微生物发酵法是生产番茄红素最适合的方法。

目前目前研究应用较多的是三孢布拉氏霉菌。

综述了通过构建番茄红素高产菌株、优化番茄红素发酵生产工艺提高番茄红素产量，最后提出目前存在的问题。

关键词：番茄红素，发酵生产，高产菌株，发酵工艺
Study on Lycopene Fermented from Blakeslea Trispora
Abstract: Lycopene is a kind of important fat-soluble carotenoid, which has many physiological functions including antioxidant function, anti-cancer, enhance immunity, protect the skin. Lycopene has a wide range of application value in food, medicine and other fields. The source of lycopene includes plant extraction, chemical synthesis and microbial fermentation. Compared with the former two methods, the microorganism fermentation method is the most suitable one for the production of lycopene. At present, Blakeslea trispora is applied widely. Building lycopene high yield strains, optimizing the lycopene fermentation production process to increase production of lycopene are reviewed, and the existing problems ar putted forward finally
Key words: Lycopene, Fermentable production, High yield strains, Fermentable process 番茄红素(Lycopene)是一种天然植物色素，为类胡萝卜素中的一种，是许多类胡萝卜素生物合成的中间体，经过环化可形成其他类胡萝卜素。

番茄红素广泛分布在各种植物中，在番茄、西瓜、胡萝卜、红葡萄柚、番石榴蔷薇果中含量较多。

番茄红素有很强的抗氧化作用，对单线氧的消除能力是β-胡萝卜素的2倍，在类胡萝卜素中最强。

随着对其生理功能的研究发现，番茄红素还具有抗癌、增强免疫力、消除单线氧自由基抗衰老、预防心血管疾病、预防白内障、抑制清除自由基保护皮肤等生理功能[1]。

而广泛应用于保健食品、医药、化妆品等行业，相关产品的开发已成为国际功能食品研究领域的热点。

番茄红素作为一种具有保健功能的食用色素逐渐受到人们的重视，在食品工业中具有广泛的应用前景。

1 番茄红素的来源
1.1 植物提取法
番茄红素在自然界中分布十分广泛。

主要存在于细胞的有色体中，多与蛋白质等形成复合物，以某些植物成熟的果实中含量较高。

番茄、西瓜、红色葡萄柚、红肉脐橙、木瓜及苦瓜籽、番石榴等植物中都有发现，含量最高的是番茄果实，可达3 mg/100 g（FW）~14 mg/100 g（FW），一般成熟度越高，番茄红素的含量也越多，且含量随品种和成熟度的不同而不同。

植物提取法提取番茄红素主要有直接粉碎法、微波法、有机溶剂提取法、酶反应法、超临界CO2萃取法等[2]，具有充分利用自然资源的优点，目前已经达到成熟阶段，因此得到大量应用。

植物提取法制取番茄红素，虽然原料来源广泛易得，但是含量较低、副产物较多，原料供应受到气候与季节的影响较大，使得生产成本较高。

1.2 化学合成法
目前，化学合成法生产番茄红素较成功的主要是德国的罗氏公司和巴斯夫公司。

1997 年10月，罗氏公司完成了工艺开发并在欧洲提出专利申请。

该工艺由三苯基氯化磷和辛三烯二醛用甲醇在2-丙醇中进行烯化反应，制得番茄红素的收率为65%。

罗氏公司将在瑞士的一个生产基地用合成工艺批量生产番茄红素，并用罗氏开发的微囊技术，微囊化工艺生产不同的番茄红素制品。

该公司宣称他们的新产品番茄红素MT 将进入食品添加剂行业，用于多种维生素、抗氧化剂、咀嚼剂的配方中。

德国巴斯夫公司也看到了番茄红素不可估量的市场潜力，投入力量进行研究开发，1997 年8 月完成了合成工艺开发，并在欧洲提出专利申
请。

该工艺由三苯基甲磺化磷与辛三烯二醛反应制得番茄红素，产品已面市[3]。

化学合成番茄红素成本低，成效快，是番茄红素的主要来源之一，但其中含多种异构体和杂质，而且大量化学试剂的使用会造成环境污染，因而禁止在保健品中使用，市场份额锐减。

1.3 微生物发酵法
微生物发酵法是利用微生物发酵生产番茄红素，与天然植物提取法和化学合成法相比，具有全年均可进行，不受季节、地理、气候影响、工艺简单、生产周期短、生产成本低、产量高、产品无毒副作用、体内吸收率高等优点，另外，生产菌可基因改造而大幅提高产量、易于放大和工业化生产，因此具有很好的发展前途。

近些年来，研究人员对利用微生物发酵生产番茄红素方面进行了大量研究，涉及微生物包括了细菌[大肠杆菌(E.Coli)]、霉菌[三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)]、酵母等各种微生物。

目前，生产天然类胡萝卜素的主要菌种为三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和红酵母(Rhodotorular)。

三孢布拉氏霉菌以其生长迅速、生物量高、产β-胡萝卜素能力强在发酵法生产番茄红素方面展现出较好的工业化应用前景。

2 三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素
2.1 高产番茄红素生产菌种的构建
选育构建高产菌种及优化发酵条件，是利用生物技术生产类胡萝卜素不可缺少的两个方面。

目前，三孢布拉霉的筛选多采用传统的诱变和原生质体融合等方法育种，近几年，随着番茄红素合成途径的阐明和相关酶基因的克隆，应用重组DNA级数构建的高产番茄红素基因工程菌的研究已经展开[4]。

其中番茄红素生物合成分为两条途径，一种是2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(2-methyl-derythritol-4-phosphate，MEP)途径合成，存在于细菌等原核微生物中；另外一种是甲羟戊酸(mevalonic acid，MV A)途径合成，存在于真菌等真核微生物中。

三孢布拉氏霉菌合成番茄红素由乙酰CoA开始，生成乙酰乙酰CoA，再经羟甲基戊二酸单酰-CoA形成甲羟戊酸(MV A)，再经过两步激酶反应，产生甲羟戊酸焦磷酸，然后脱羧生成番茄红素合成的前体物质IPP。

另外，美国专利报道将控制番茄红素合成的基因crtE、crtB、crtI转入拟分枝孢镰刀菌，得到0.5mg /g细胞干重的番茄红素[5]。

国内外研究者对此已做了大量研究。

三孢布拉霉菌生产β-胡萝卜素已经实现工业化。

β-胡萝卜素是由番茄红素经番茄红素环化酶(l ycopene cyclase)环化形成。

所以通过基因突变、基因敲除、基因干扰等方法阻断β-胡萝卜素生物合成途径中最后两步环化反应，也可积累产生番茄红素，并提高番茄红素的产量。

汤晖等[6]通过重叠延伸PCR的方法克隆了三孢布拉氏霉菌carRA基因，通过构建原核表达载体pET28a-carRA，分别验证了番茄红素环化酶及八氢番茄红素合成酶功能活性，为定点突变番茄红素环化酶活性位点而不影响八氢番茄红素合成酶功能活性提供了筛选模型。

2.2 番茄红素发酵生产工艺优化
2.2.1 阻断剂
根据Blakesleatrispora的代谢途径，阻断从番茄红素到β-胡萝卜素的代谢途径即可实现番茄红素的富集。

通过子在适当的时间添加适当的阻断剂可以与生物合成β-胡萝卜素过程中的环化酶结合，从而使环化酶丧失活性，无法与番茄红素结合，阻断了生成β-胡萝卜素的反应，使得最终产物停留在番茄红素的阶段，从而大量积累番茄红素。

目前所用的阻断剂主要有两类，一类为叔胺类化合物，如：对二甲氨乙基苯酚、三乙胺、2-二甲氨基乙苯、2-二甲氨基乙苯等；另一类为含氮的杂环化合物，如：烟碱、砒啶、烟草废弃物、哇琳和某些取代衍生物。

修宇等[7]在发酵48 h后添加2-(4－甲基苯氧)-三乙基胺(MPTA)可以抑制96%β-胡萝卜素的合成，添加烟草可增加总类胡萝卜素的产量，进行优化以后得到番茄红素的总产量达到205 mg/L，占总类胡萝卜素的94%。

用三孢布拉氏霉菌发酵生产技术获得的结晶番茄红素, 经异丁基醋酸盐再结晶可得到高纯度的反式番茄红素。

Choudhari等[8]研究几种化学阻断剂如咪唑、吡啶、三乙胺、哌啶、烟酸对番茄红素发酵的影响，发现在含有充维生素A醋酸酯的发酵培养基中添加500mg/L哌啶，番茄红素产量提高7.76倍，达到了775mg/L。

Wang Jingfeng等[9]对三孢布拉霉NRRL 2895(+)和NRRL 2896(-)摇瓶生产番茄红素发酵工艺进行了系统优化，研究发现正、负菌株的比例、番茄红素环化酶抑制剂砒啶和肌酐、三孢酸结构类似物脱落酸、3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-COA)前体物亮氨酸以及甲羟戊酸激酶激活剂青霉素是影响番茄红素合成的关键因素。

在最佳的发酵条件下，即发酵液中正负株的最佳比例为5:1，发酵过程中添加6g/L肌酐、0.1g/L 青霉素、150μmol/L脱落酸及0.5g/L的亮氨酸，番茄红素产量可达(156.2±15.4)mg/L，比优化前提高了134.9%。

2.2.2 氧载体与表面活性剂
三孢布拉氏霉菌属于高度嗜氧嗜黏度的微生物，因培养基中常使用淀粉、糊精等增稠剂，导致培养基黏度大、固型物含量高，致使发酵系统的溶氧速率降低，菌体生长过程中容易纠结成团，导致对数生长期溶氧量远远不够。

提高搅拌转速能够在一定程度上提高溶氧速率，但高搅拌转速形成的高剪切力，使得菌体受损，生物活性降低致使生物量减小，仅单纯加大通气量，在发酵处于对数生长期时，仍然达不到要求。

对此，研究表明，可以通过添加氧载体表面活性剂提高同一反应系统的传氧系数来提高番茄红素的产量。

朱艳[10]在发酵第1天的时候添加H2O2到发酵体系中，可以提高番茄红素的产量达到40% 。

在发酵刚开始分别加入1%的氧载体正己烷、正十二烷，可使产量分别提高25%和72%。

并且在添加氧载体的同时，进行了各种表面活性剂的添加实验，选取了Span20、Tween20 、Tween80和Triton-x100为代表，进行了复合实验，番茄红素产量大幅提高，最高可提高114%，优于单一添加氧载体或表面活性剂。

王常玲[11]在发酵过程6h时，添加0.13%的表面活性剂大豆卵磷脂，番茄红素的产量达到最大值1.58g/L，比对照提高了56.44%。

刘淑惠研究了发酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附气体的性质，增加发酵液中溶解氧的浓度，改善发酵液黏度，促进三孢布拉霉菌的生长，番茄红素的产量提高为原产量的150%以上。

2.2.3 培养基
培养基是微生物生长的基础，在三孢布拉氏霉菌（B.trispora）（+）NRRL 2895和（-）NRRL 2896的培养过程中加入醋酸维生素A 1 000 mg/L，在摇瓶中培养使番茄红素的产量达（775 5）mg/L。

王航等在摇瓶中对三孢布拉氏霉菌（B.trispora）（+）ATCC 14271和（-）ATCC 14272的培养方法进行改进及优化，提出将混合好的正负菌株的孢子悬液直接接种到发酵培养基的一级培养工艺，发酵120 h后番茄红素的产量达314 mg/L，使番茄红素的产量比传统工艺提高了34 % 而尽可能地利用成分简单且价格低廉的培养基向来是发酵工程的宗旨，尤其是利用生物质原材料，这就涉及到原材料的选择及处理问题。

此外，由于三孢布拉氏霉菌（B.trispora）在发酵过程中进行接合生殖，在发酵培养过程中正负菌株的接种种龄及混合配比也显得尤为重要，这也是提高三孢布拉氏霉菌生产番茄红素能力的重要途径。

LopezNieto等[12]发现在发酵培养基中加入卵磷脂或者柑橘渣时能够使产量分别提26%、58%，并增加菌体的生物量。

用油菜籽油或葵花籽油来替代大豆油能增加番茄红素的产量，使用葡萄糖替代油类或者延时加入油类，都使得番茄红素的产量降低这说明油类在番茄红素合成的初期即开始被利用。

2.2.4 其他因素
另外，三孢布拉霉发酵生产番茄红素还受机械搅拌罐中的pH、温度因素的影响。

有研究表明中性偏高有利番茄红素形成，方法是添加碳酸钠保持发酵液pH6.6以上，有关工艺已有专利申请，产量0.15g/L。

产生番茄红素的最佳温度25℃，较高的温度(28-30℃)将会增加β-胡萝卜素等的含量，降低番茄红素的产量。

3 结语
因番茄红素纯品价格昂贵、稳定性差、成本较高等问题，导致其应用受到了极大限制。

因此降低生产成本、提高番茄红素产量一直是微生物发酵生产番茄红素研究的关键。

微生物发酵法生产番茄红素相较于天然植物提取法、化学合成法，是一种高品质、低成本的生产技术。

其生产的产品具有天然、绿色、无毒、无溶剂残留和无重金属残留的优点，且生产原料来源广泛而廉价。

然而，目前微生物发酵法生产番茄红素的研究多集中在实验室规模，且对整个番茄红素的发酵过程控制和代谢调控的研究还相对较少，对影响番茄红素产量生产效率和工业化放大的基础和应用研究还没有跟进，因此应对以下几个方面的问题进行深入研究：(1)番茄红素生产菌株的选育；(2)生物合成代谢途径的调控；(3)发酵专用工艺设备的研制；
(4)发酵过程耦合强化及集成；(5)发酵过程中多维系统生物学研究。

4 参考文献
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