10核酸的性质

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis）
用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段
核酸序列分析
核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸 为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。先 以外切酶确定5’-或3’-末端核苷酸，再以内切酶 将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷 酸组成、比例和序列。最后将核苷酸序列的各 寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序 列。
都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使 RNase失活，在实验反应体系中要加RNase的抑制 剂
目前常用的分离方法为胍盐/氯化铯密度梯度离心
(RNA密度1.89， DNA密度~ 1.71，蛋白质密度 1.33)。另一种方法为酸性胍盐/酚/氯仿法
核酸的定量研究
利用碱基、糖、磷酸基进行测定 紫外分光光度法：利用碱基260nm的紫外吸收测定核酸含量 纯度： DNA: A260/A280 大于1.8， RNA达到2.0，如果含有杂 蛋白以及苯酚， A260/A280比值明显下降 定量： 1个吸光值相当于 50 g/mL 双链DNA 40 g/mL 单链DNA(或RNA) 20 g/mL 寡核苷酸
DNA的酶法测序
由Sanger终止法原理 设计的DNA测序仪原理
问 题
RNA的序列如何测定？
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然 DNA复制。靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA 分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合 适和条件下，由耐热的Taq DNA聚合酶催化引物 由5’ -3’ 扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子， 并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、 延伸循环，模板DNA增加一倍。经过30～50个循 环，可使原DNA量增加106～109倍
RNA的杂交: Northern印迹
核酸的分离提纯
核酸的分离、提取通则
为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0º ～4℃） 2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌 3．防止核酸酶的作用
抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去 污剂十二烷基硫酸钠(SDS)；或加蛋白变性剂
底物 耐热TaqDNA聚合酶：DNA合成工具酶
适当的缓冲体系并有Mg2+存在
PCR的引物设计
PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的 设计是PCR成功的关键
• 引物位臵和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200～800bp之间
• 引物的长度
一般为18～25bp
• 末端核苷酸
3端不得有任何修饰 • G＋C含量和Tm值 一般在40－60%之间，两条相差2－3 ℃
DNA的酶法测序
20世纪60年代，R.W.Holley 首先测定了酵母tRNAala的碱 基序列，采用的类似氨基酸 测序的重叠法，非常繁琐 1975年，Sanger采用了一种 新型的快速测序方法-加减 法 1977年Sanger改进了测序方 法，称为末端终止法，速度 更快 根据Sanger的方法，现在已 经有各种自动化测序仪
按底物专一性分：RNA酶(RNase)、DNA酶(DNase) 按作用方式分：核酸内切酶、核酸外切酶 按作用键分：水解3’-磷酸酯键和5’-磷酸酯键的核酸酶， 产物分别是5’-磷酸核苷和3’-磷酸核苷
核糖核酸酶举例
牛胰核糖核酸酶(RNase I): 内切酶，水解嘧啶3’-磷酸和 其他核苷酸5’-OH形成的酯键，产生3’-磷酸核苷 核糖核酸酶T1: 内切酶，发现于米曲霉，水解3’-鸟苷酸 与其他核苷酸的5’-OH形成的酯键，产物为3’-鸟苷酸为 末端的寡核苷酸
PCR的基本步骤
• 模板DNA的变性
一般选用95℃左右1min，使DNA双链解为单链
• 复性
按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min
DNA的分离提纯
在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下用蛋白酶消化细胞，
再用苯 酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA， 操作在低温下进行，防止过酸、过碱，或机械振 荡，可得到高质量的DNA
*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些
RNA的分离提纯
RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液
核酸的水解
酸或碱水解
核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别(具有重要的生物学意义)
在0.1mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2’-或3’-磷 酸腺 苷；DNA在同样条件下则不受影响 这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2’-OH的参与作用有很大的关系。 在RNA水解时，2’-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯 键的同时 形成环状磷 酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物
核酸的定量研究
定磷法(钼蓝比色)
浓硫酸水解核酸的磷酸，酸性条件下磷酸与钼酸形成磷钼酸， 用还原剂还原磷钼酸，660nm比色测定含量
定糖法
RNA: 核糖与盐酸共热生成糠醛，然后与地衣酚生成鲜绿色化 合物，670nm比色测定含量
DNA: 脱氧核糖与二苯胺共热生成蓝色化合物，595nm比色测 定含量
N-糖苷酶
水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末端的寡核苷酸
酶水解
限制性内切酶
限制性内切酶
核酸的紫外吸收
核酸碱基的键，在260nm附近强吸收，DNA的A260/A280约为1.8以上， RNA为2.0 DNA的摩尔磷紫外吸收(P)约为6000，变性后变为10000， DNA双螺旋结 构使碱基对堆积，造成电子云重叠，产生低吸收效应，变性破坏DNA 的碱基对，因此使紫外吸收增大 RNA可局部形成双螺旋，其(P)约为7000-10000，随环境条件不同而变化
脱氧核糖核酸酶举例
牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase I)：内切酶，水解DNA 3’磷酸酯键，产生5’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核 苷酸 牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II)：内切酶，水解DNA 5’磷酸酯键，产生3’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个核 苷酸 限制性内切酶，可识别特异的碱基序列并水解断开，产 物带5’-磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具 酶
核酸的凝胶电泳
可进行核酸分离，知道核酸的纯度 测定分子量大小 估计核酸的构象
超螺旋 线型 开环
核酸的琼脂糖凝胶电泳
制胶
电泳
显色
凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应
1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）
适用于大分子核酸，一般用于DNA分析 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、 核酸构象、电流等有关
病毒DNA)变性温度范围小，异质 DNA变性温度范围大
GC含量： 经验公式：GC%=(Tm-69.3)2.44 离子强度：离子强度低的介质，Tm较低，熔 解温度范围较宽
核酸均一性对变性的影响
核酸GC含量对变性的影响
离子强度对变性的影响
* DNA样品一般在含盐缓冲溶液中保存较为稳定
RNA的变性
熔点(Tm) DNA双螺旋结构发生一半变性 时的温度，又叫做熔解温度、变 性温度、解链温度
变性温度一般在80~100C
核酸的变性
变性后的性质变化
紫外吸收增大(增色效应) DNA 25%~40%， RNA 1% 粘度、比旋光度减小 生物活性降低或丧失
影响Tm的因素
DNA 的均一性：均质DNA(polydG、CpolydAT、
• 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可 能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此 又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃
核酸的复性
DNA复性过程符合二级反应动力学
核酸的复性
复性 也称退火
慢 冷 却
缓
高于Tm值5℃
迅
速
冷
却
理化性质:
(p)
↓
比旋光度↑
粘度↑
生物活性得到部分恢复
核酸的杂交
核酸的紫外吸收
习 题
• 通常DNA纯制品的A260／A280（即DNA样品在 260 nm和280 nm这两个紫外区光吸收的比值） 介于1.65和1.85之间。RNA污染会导致该比值 过高，而蛋白质或者酚类物质的污染会导致该 比值过低，请解释其中的原因
核酸的变性
变性 核酸双螺旋区因加热、酸、碱 和低离子强度的影响，碱基对 拆离，双链解开，称为变性 变性不涉及共价键的断裂 磷酸二酯键断裂则为降解
酸易水解N百度文库糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖 的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成无嘌呤酸 碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的N以及各取代基具有结合和释放质子的 能力 碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即被水解，DNA对碱相对较稳定
酸或碱水解
酶水解
核酸酶的分类
碱基的解离
戊糖(pentose)
HOH2C H H OH O H H OH H OH H OH HOH2C H O H H
H OH
OH
HOH2C H
O H
OH H OCH3
β-D-核糖
β-D-2-脱氧核糖
β-D-2-O-甲基核糖
磷酸基的解离
pKa1=2
+ H
+ H
+ H
2- pKa3=12
抑制RNase：
（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的 用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）处理 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的 抑制剂
DNA的分离提纯
真核生物DNA与蛋白质的复合物(DNP)溶于水和浓
盐溶液，但不溶于0.14mol/L的盐溶液，用苯酚或氯 仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液
具有双螺旋区段的RNA也具有变性性质 由于RNA双螺旋区段小，因此变性Tm较小 tRNA具有较多的双螺旋区，因此有较高的Tm
核酸的复性
• 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合 成为双螺旋结构的过程称为复性 • DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生 物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效 应
H3PO4
H2PO4
-
pKa2=7
HPO4
PO4
3-
核酸的两性性质和等电点
核酸分子中同时含有酸性基团(磷酸基)和碱性基 团(氨基)，因而具有两性性质 磷酸是中等强度的酸，碱基是弱碱，因此核酸的 等电点比较低
DNA 4~4.5 RNA 2~2.5
原因：RNA分子核糖基2’-OH通过氢键促进了磷酸基质 子的解离
核酸的性质
核酸的酸碱性质
• 核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此 核酸是两性电解质 • 碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的N以及各取代基 具有结合和释放质子的能力 • 核苷的解离：核糖和碱基具有结合释放质子的能 力
• 核酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两 性电离主要决定于磷酸基和含氮碱基
碱基的解离
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction (PCR)
模板DNA: 含有待扩增DNA片段的双链DNA分子
引物：确定待合成DNA的在模板上的位臵，提供
DNA聚合酶起始DNA合成的3’-OH，一对 合成DNA引物确定一个DNA片段
四种脱氧单核苷酸(dNTP)：合成DNA所需的反应
DNA的酶法测序
二脱氧核糖核苷三磷酸
DNA的酶法测序
DNA酶法测序
平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模 板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反 应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其 随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四 组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA 链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开， 经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA 的核苷酸序列,如下图所示：
杂交(hybridization) 不同来源的单链核酸之间通 过碱基互补形成双螺旋结构 Southern 印迹法 (Southern blot) 用标记核酸探针检测同源 DNA限制片断 Northern 印迹法 用标记核酸探针检测同源 RNA限制片断
核酸的杂交
DNA的杂交: Southern印迹