根瘤菌的分离与鉴定

每个单株植物 的根瘤收集在一个 卫生纸包中，每个 采集点的多个植株 放在一个装有硅胶 的自封袋中。
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分离及纯化
1. 用无菌水浸泡干燥根瘤菌直至其复原。 2 .用95%的酒精浸泡3~5分钟，用5%的NaClO3 浸泡1分钟， 用无菌水清洗 5~7次（换水）。（在超净台上操作， 并且在酒精灯附近，防止染菌）
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分离及纯化
消毒
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刺破
划线
分离及纯化
4.待平板出现菌落后，观察，选取目的菌落再 次划线纯化，镜检。 5.纯化后的菌划线在试管斜面培养基上，供保 菌。
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分离及纯化
稀释1万倍
挑菌，摇菌
根瘤菌的分离与鉴定
L/O/G/O
采集
(1) 照相 (2) 挖掘和根瘤保存
根瘤选取：大个、新鲜、粉红色、尽量多取。 根瘤采集：1.主根上可以剥取少量根皮以保证根瘤完整。 2.侧根上的可带少许根。
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采集
农大豆2号
保豆3号
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保存
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分离及纯化
(1) 根瘤浸泡
(2) 根瘤消毒
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分离及纯化
3.用牙签（灭菌时尖头朝上，平头朝下）的平
头端在灭菌的玻璃平皿上将根瘤刺破（必要时可以 滴加一滴无菌水）。用灭菌接种环蘸取菌液在YMA 固体培养基上划线。用灭菌接种环蘸取同种菌液， 在载玻片上进行革兰氏染色，镜检。
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鉴定
16S rDNA序列测定：方法同书。 其中：dNTP：2.5mm 引物：10μm 测序后，在NCBI blast 中进行比对， 一般情况下，相似性能达到99%左右。
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稀释2万倍
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稀释100万倍
保菌
使用YMA液体 +20%甘油，吹 打斜面上的菌， 吸取保存。 使用YMA液体 +20%甘油，吸 取摇好的单个菌 斑菌液。
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提取基因组DNA
260/280:1.97
260/230:2.02 浓度：570ng/μl