根瘤菌的分离与鉴定
紫花苜蓿根瘤菌的鉴定及其与土壤理化性质相关性分析
紫花苜蓿根瘤菌的鉴定及其与土壤理化性质相关性分析紫花苜蓿（Trifolium pratense L.）是一种广泛种植的牧草和绿肥植物，其与根瘤菌的共生对土壤氮素固定和植物生长发育有重要影响。
本文旨在利用分子生物学技术对紫花苜蓿根瘤菌进行鉴定，并分析其与土壤理化性质之间的相关性。
为了确定根瘤菌的菌株类型，我们自农田土壤中分离紫花苜蓿根部的根瘤样品，并使用无菌技术将根瘤菌分离培养。
然后，从分离培养的纯株中提取细菌基因组DNA，并使用通用引物扩增16S rRNA基因，得到了长度为约1.5 kb的DNA片段。
通过测序并与NCBI数据库进行比对，我们得到了根据16S rRNA基因序列确定的根瘤菌的物种分类。
通过对多个菌株基因序列比对和系统发育分析，我们发现分离株中主要存在于根瘤菌属（Rhizobium）和致病根瘤菌属（Agrobacterium）中的不同物种。
其中，绝大部分菌株属于根瘤菌属，与已报道的Rhizobium leguminosarum和Rhizobium trifolii最为相似。
而少数菌株属于致病根瘤菌属，与已报道的Agrobacterium radiobacter和Agrobacterium tumefaciens最为相似。
这些结果表明，紫花苜蓿与多种根瘤菌共生，其中优势菌株属于Rhizobium属。
然后，我们收集了不同地点的土壤样品，并分析了其理化性质，包括土壤pH值、有机质含量和速效氮含量。
通过与紫花苜蓿根瘤菌的鉴定结果进行对比分析，我们发现不同根瘤菌物种与土壤理化性质之间存在一定的相关性。
首先，我们发现根瘤菌的物种组成与土壤pH值密切相关。
在土壤pH值较高（6.5-7.5）的地区，多数菌株属于Rhizobium属；而在土壤pH值较低（5.0-6.0）的地区，少数菌株属于Agrobacterium属。
这与已有研究结果一致，表明不同根瘤菌物种对土壤pH值有不同的适应性。
其次，我们发现根瘤菌的物种组成与土壤有机质含量密切相关。
大豆根瘤菌共生基因的筛选以及三型分泌系统效应分子的鉴定
功能验证：通过基因敲除、 过表达等方法，验证三型 分泌系统效应分子的功能
鉴定过程
01
筛选大豆根瘤菌共生基因
03
鉴定效应分子的功能
05
确定效应分子的表达调控
0 2 提取三型分泌系统效应分子 0 4 验证效应分子的作用机制 0 6 研究效应分子的应用前景
鉴定结果
筛选出多种三型 分泌系统效应分
子
发现这些效应分 子在大豆根瘤菌
共生中的作用
鉴定出这些效应 分子的功能
鉴定结果对大豆 根瘤菌共生研究
的意义
结果分析
筛选出三型分泌系统 效应分子
分析三型分泌系统效 应分子对大豆根瘤菌
共生的影响
鉴定出三型分泌系统 效应分子的功能
探讨三型分泌系统效 应分子在大豆根瘤菌
共生中的作用机制
共生基因与三型分泌系统效应 分子的关系
三型分泌系统效应分子的鉴定 结果：通过实验鉴定出三型分
泌系统效应分子。
共生基因的筛选结果：通过实 验筛选出与大豆根瘤菌共生相
关的基因。
共生基因与三型分泌系统 效应分子的相互作用：分 析共生基因与三型分泌系 统效应分子之间的相互作
用关系。
结论总结
共生基因的筛选可以揭示三 型分泌系统效应分子的功能。
大豆根瘤菌共生基因与三型 分泌系统效应分子之间存在 密切关系。
基因克隆：将分离出的共生基 因进行克隆，以便进一步研究。
基因功能分析：通过基因敲除、 过表达等方法，分析共生基因 在大豆根瘤菌共生中的功能。
筛选结果
筛选出多个与大 豆根瘤菌共生相
关的基因
筛选结果有助于 进一步研究大豆 根瘤菌共生机制
基因的功能和作 用机制得到初步
山西大豆根瘤菌的分离、鉴定及共生匹配性筛选
山西大豆根瘤菌的分离、鉴定及共生匹配性筛选王晓丽;秦杰;王敏;王利祥;杜维俊【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2022(38)3【摘要】山西作为大豆起源地之一,根瘤菌资源丰富。
为了进一步挖掘山西省的大豆根瘤菌资源,筛选出与当地主栽大豆品种共生固氮效果好的根瘤菌。
本实验在大同广灵、太原清徐、晋中太谷三地采集不同大豆品种的根瘤,经过多次划线,对分离纯化出的单菌落进行菌落形态、刚果红染色、BTB染色表型鉴定;16S rDNA、nodA和nifH基因型鉴定。
利用BOX-PCR对所有根瘤菌进行电泳检测,去除条带完全一致的菌株,将目的条带不一致的菌在***************软件中聚类分析。
选代表性菌株接种到晋大88号和科丰1号两个大豆材料,筛选匹配性好的菌株。
共分离出203株菌,其中187株根瘤菌可以扩增出nodA、nifH基因,172株快生型根瘤菌,属于S.fredii;15株慢生型根瘤菌,分别属于B.diazoefficiens和B.daqingense。
BOX-PCR将85株条带不一致的根瘤菌分为四大类群,以70%为界限共分为16类。
筛选出与晋大88号匹配性较好的根瘤菌GL11和GL43,其地上部分干重较接种USDA110分别增加38.5%、30.1%;根干重分别增加22.2%、27.8%;根瘤鲜重分别增加24.3%、41.5%;根瘤干重分别增加36.6%、31.0%。
筛选出与科丰1号匹配性较好的根瘤菌TG37,其株高、地上干重、根干重、根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数较接种USDA110分别增加8.1%、15.0%、28.6%、27.3%、44.3%和60.6%。
山西省根瘤菌资源丰富,种类多样,S.fredii为优势种,此外还分离出两类慢生型根瘤菌B.diazoefficiens和B.daqingense,丰富了根瘤菌资源。
筛选出共生匹配性好的根瘤菌为大豆生产实践奠定了物质基础和理论依据。
紫云英根瘤菌的分离与鉴定
管 凤 贞 ，钟 少 杰 ，邱 宏 端 ，等 ． 紫 云 英 根 瘤 菌 的分 离 与 鉴 定 Ｅ］ 福 建 农 业 学 报 ，２ １ ，２ （） ２ —５ ２ Ｊ． ０ ２ ７ ５ ：５ ４ ３ ． ＧＵＡＮ ＦＺ ＨＯＮＧ ＳＪ － ，Ｚ －，ＱＩ Ｈ— Ｕ Ｄ，ｅ ａ Ｉｏａｉｇａ ｄＩｅｔ ｉ ｔ ｎｏ ｈｚｂａ ｒｉｓｏ ｈｎ ｓ ｌ ｔｈ Ｉ ］ ｔ １ ｓｌｔ ｎ ｎｉｃ ｉ ｆ ｉｏｉｌｔａｎ ｆ ｉｅｅＭｉ Ｖｅｃ Ｊ ．ＦｕｉｎＪ ｕｎ ｌ ｆ ． ｎ ｄ ｆａｏ Ｒ ｓ Ｃ ｋ － ｊａ ｏ ｒａ ｏ
Ａｇｒｃ ｌｕｒ ｌＳｃｅ ｃｓ， ２ １ ， ２ （ ： ５ ４— ５ ２ ｉｕ ｔ ａ ｉｎ ｅ ０２ ７ ５） ２ ３．
紫 云英 根瘤 菌 的分 离 与鉴 定
管凤 贞 ，钟 少杰。 宏 端 。 ，邱 ，林 戎斌 张 辉 陈济 琛 林 新 坚 ， ， ，
（ ＿福 建 省 农 业 科 学 院 土壤 肥 料 研 究 所 ，福 建 １ 福建
Ｃ ｉａ ．Ｌ ｆ ｉ ｃ ｅ ａ ｔ ｎ ｏ ｒｃ ｌ ｒ ｌ ｎ ｖ ｒｉ ｆ Ｆ ｊａ ｈ ｎ ；３ ｉ ｅ ｃ ｎ ｅｄ ｐ ｒ ｓｅ ｍｅ ｔ ｆ Ａｇ ｉ ｔ ａ ｉｅ ｓ ｙ ｏ ｕ ｉｎ，Ｆｕ ｈ ｕ ｕ ｕ Ｕ ｔ ｚ ｏ ，Ｆ ｊａ ３ ０ ０ ， ｈ ｎ ） ｕ ｉ ｎ ５ ０ ２ Ｃ ｉａ
ＧＵＡＮ ｅ ｇｚ ｅ ，Ｚ Ｆ ｎ —ｈ ｎ ＨＯＮＧ ｈ ｏｊｅ ，ＱＩ Ｈｏ ｇ ｄ ａ Ｓ ａ—ｉ Ｕ ｎ — ｕ ｎ ，ＬＩ Ｒｏ ｇ ｂｎ ，Ｚ Ｎ ｎ － ｉ ＨＡＮＧ ｉ， Ｈｕ ＣＨＥＮ ｉ ｈ ｎ Ｊ— ｅ ，Ｌ Ｎ ｎｊａ ｃ Ｉ Ｘｉ－ｉｎ （ ． Ｓ ｉ ｎ ｒｉｉｅ ｎ ｔｔｔ ＿ Ｆｕ ｉｎＡｃ ｄ ｍｙｏ １ ｏｌ ｄ Ｆｅｔｌｚ ｒＩ ｓｉｕｅｏ 、 ｊａ ａ ｅ ｆＡｇｒｃ ｌｕ ａ ｃｅ ｃｓ ａ ， ｉｕ ｔｒ ｌＳ ｉｎ ｅ ，Ｆｕ ｈ ｕ，Ｆｕ ｉｎ ３ ０ ０ ｚｏ ｊａ ５ ０ ３， Ｃｈ ｎ ｉａ；２ Ｂｉｌｇ ｃ ｌ ｃｅ ｃ ｎ ｇ ｎ ｅ ｉｇ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆ Ｆｕ ｈ ｕ Ｕｎ ｖ ｒｉ ． ｏｏ ｉａ ｉｎ ｅａ ｄ Ｅｎ ｉ ｅｒｎ ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｚ ｏ ｉｅ ｓｔ Ｓ ｙ，Ｆｕ ｈ ｕ，Ｆｕ ｉ ｎ ３ ０ ０ ｚｏ ｊａ ５ １ ８，
大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定
大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定韩孝强（天津农学院农学系）1 前言根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌。
如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体[1]。
常制成细菌制剂即一种生物肥料在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段。
美国、澳大利亚、新西兰、日本、意大利、奥地利、加拿大、法国、荷兰、芬兰、泰国、韩国、印度及非洲的一些国家，至少有70多个国家研究、生产和应用豆科根瘤菌，不仅面积不断扩大，而且应用的豆科植物种类也日益繁多。
在美国、巴西等大豆种植的主要国家，根瘤菌接种率达到95%以上[2]。
世界各国一直在研究与豆科作物及其品种相匹配的优良根瘤菌生产用菌株，根瘤菌剂产品在稳步提高[3]。
我国微生物肥料的研究始于20世纪40年代，其研究与应用已有几十年的历史，在我国的农业生产中起了非常重要的作用。
最早研究应用的是根瘤菌制剂，代表和奠基人有张宪武先生、陈华癸院士和樊庆笙先生等[4]。
众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要[5]。
而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题[6]。
因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标[7]。
传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定[8]。
但近几十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定[9]。
周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定
周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定张怡;李成伟;张超;杨艳杰;于洁;季慧佳;陈红;刘文婷;李晓博;李蒙【摘要】In order to explore new rhizobium resource,the method of separating and purifying the root nodule bacteria from soybean root nodules was studied,and a pot experiment was carried out.The results showed that the isolated rhizobium of soybean could form nodules in soybean and alfalfa.According to the published soybean rhizobium common node tumor genes of nodA,nifH,16S rDNA,all the three genes were amplified.Phylogenetic analysis demonstrated that the strain isolated from Zhoukou was highly conserved with Sinorhizabium fredii of Germany,which convinced that rhizobium strain was S.fredii.The research provided the quick and accurate method for identification of soybean rhizobium at the molecular level.%为了进一步研究发掘新的根瘤菌资源库,采用平板划线分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌,并且将获得的菌株进行盆栽回接试验,结果表明,分离获得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上结瘤,具有结瘤能力.根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA、nifH、16S rDNA保守区域设计引物,并且对nodA、nifH、16S rDNA序列进行扩增分析和系统发育分析,由此鉴定分离的根瘤菌为费式中华根瘤菌,从而在分子水平上实现了对大豆根瘤菌的快速鉴定.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2017(032)004【总页数】5页(P98-102)【关键词】大豆;根瘤菌;回接鉴定;费式中华根瘤菌【作者】张怡;李成伟;张超;杨艳杰;于洁;季慧佳;陈红;刘文婷;李晓博;李蒙【作者单位】周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;河南科技学院,河南新乡 453007;杭州师范大学医学院,浙江杭州 310000;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;周口师范学院,植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001【正文语种】中文【中图分类】S432.4根瘤菌(Rhizobia)是一类与豆科植物共生，在其根部或者茎部形成根瘤并且固定空气中的氮气为植物提供营养的一类革兰氏染色阴性杆状细菌[1]，其作用机制主要是通过从植物的根毛侵入根内形成根瘤或者侵入茎部形成茎瘤，并且以共生体的形式固定空气中的N2来为豆科植物提供可以利用吸收的豆科植物的共生固氮体系发挥着非常重要的作用，尤其是在维持农作物生产力和维护半干旱土地的土壤肥力方面。
优良根瘤菌菌株筛选与鉴定技术研究
优良根瘤菌菌株筛选与鉴定技术研究优良根瘤菌菌株的筛选与鉴定技术研究根瘤菌是一类生活在植物根部与其共生的微生物，它们与植物形成共生关系，能够固氮和供给植物必需的氮营养，提高植物的生长和产量。
因此，筛选和鉴定优良的根瘤菌菌株对于农业生产和生态环境具有重要意义。
本文将重点探讨根瘤菌菌株筛选与鉴定的相关技术。
1. 根瘤菌菌株筛选技术根瘤菌的筛选是通过鉴定植物根瘤中的菌株来进行的，主要包括以下几个步骤：1.1 植物根瘤的采集与分离首先，我们需要在农田或实验室中收集不同植物根瘤样品，包括豆科植物（如大豆、绿豆）和非豆科植物（如黄连木、山东花椒）。
然后，将根瘤样品进行分离，可以通过灭菌的方法将根瘤剪切并悬浮于适宜的培养基中，培养基中包含碳源、氮源、矿质元素等。
1.2 菌株的纯化与培养将分离得到的根瘤菌菌株进行纯化，可以通过菌落转接法、层析法等方法纯化单株。
然后，在合适的培养条件下进行扩培，常用的培养基包括YMA培养基和BMM培养基等。
培养的条件需要控制温度、pH值等因素，以保证菌株的生长。
1.3 菌株的特性筛选在菌株的培养基上观察和筛选菌株的生理和形态特性。
例如，根瘤菌菌株的菌落形状、色素产生、胞外多糖分泌等特性可以通过目测进行初步筛选。
此外，一些生理指标如产生IAA（吲哚-3-乙酸）、溶磷、溶钾等也可以作为筛选指标。
1.4 微生物学特性的鉴定对于分离得到的根瘤菌菌株，可以通过一系列的微生物学鉴定方法进行准确定性。
包括菌落形态观察、生理生化测试、结构鉴定、酶谱分析、抗生素抗性分析等。
这些方法可以帮助我们了解根瘤菌的基本特性，并与已有的参考菌株进行比较。
2. 根瘤菌菌株鉴定技术鉴定根瘤菌的最终目的是确定其分类学和系统学地位置。
鉴定可以根据菌株的形态特征、生理生化特性、分子生物学特性等方面进行。
2.1 形态特征的鉴定根瘤菌菌株的形态特征是鉴定的重要依据之一。
通过观察菌株的菌落形态、菌丝形态、孢子形态等可以对菌株进行初步的鉴定分类。
大豆根瘤菌的分离与分子鉴定
第19卷第5期黑龙江八一农垦大学学报19（5）：16～19文章编号：1002-2090(2007)05-0016-04大豆根瘤菌的分离与分子鉴定高亚梅，韩毅强，王景伟，汤辉，孙东梅，王彦杰，王伟东（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院， 大庆 163319）摘要：为进一步发掘新的根瘤菌资源，丰富和充实根瘤菌资源库，本研究采用平板分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌，获得的菌株进行盆栽回接试验，结果表明分离获得的5株根瘤菌代表菌株均可在大豆上结瘤，具有结瘤能力。
根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA保守区域设计引物对其进行了分子鉴定均获得了nodA PCR 扩增产物，从而在分子水平上实现了对根瘤菌的快速鉴定。
关键词：大豆；根瘤菌；回接鉴定；共同结瘤基因nodA中图分类号：S154.381 文献标识码：AIsolation and Molecular Identification of Soybean RhizobiaGAO Ya-mei, HAN Yi-qiang, WANG Jing-wei, TANG Hui,SUN Dong-mei, Wang Yan-jie, WANG Jing-weiAbstract: In order to discover new soybean rhizobia resource and screen highly efficient soybean rhizobia for our region, soybean rhizobia was isolated and purified from soybean nodule by plating and the strains isolated were used to carry out pot culture experiment. Results showed that all the five representative strains gained could nodulate in soybean plant. Therefore all of them had the ability of nodulation. PCR amplification of common nodulation gene nodA was carried out using primer designed acoording to the conserved region of nodA. All the representative strains got nodA PCR products. Therefore the characteristics of strain nodulation belonging to rhizobia could be judged quickly from nodA at the level of molecule.Key words:soybean; rhizobia; re-inoculation and identification; common Nodulation Gene nodA0 前言根瘤菌(rhizobia)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其侵染豆科植物根部或茎部后形成根瘤或茎瘤，以共生体形式固定空气中的N2为植物可吸收利用的NH4+。
大豆根瘤菌生产工艺流程
大豆根瘤菌生产工艺流程
大豆根瘤菌是一种对大豆植株有益的固氮菌，其生产工艺流程
通常包括以下几个主要步骤：
1. 菌种培养，首先需要选择高效的大豆根瘤菌菌种，然后在适
当的培养基上进行培养，以获得大量的活菌种。
2. 发酵生产，将培养好的菌种接种到发酵罐中，加入适量的培
养基和其他营养物质，控制好发酵温度、pH值和通气量等参数，进
行发酵培养，以获得高活性的大豆根瘤菌发酵液。
3. 分离提取，将发酵液进行分离提取，通常采用离心、过滤等
方法，获得纯净的大豆根瘤菌菌体或发酵液。
4. 菌剂制备，将提取得到的大豆根瘤菌菌体或发酵液进行浓缩、干燥等处理，制成大豆根瘤菌菌剂，以便于储存和运输。
5. 质量控制，在整个生产过程中，需要对菌种培养、发酵生产、分离提取和菌剂制备等环节进行严格的质量控制，确保产品的质量
稳定。
除了以上主要步骤外，大豆根瘤菌生产工艺流程还涉及原料准备、设备清洁消毒、生产环境控制等多个方面。
同时，针对不同菌株和不同产品形式（如固体菌剂、液体菌剂等），生产工艺流程也会有所差异。
总的来说，大豆根瘤菌生产工艺流程需要严格控制各个环节，确保产品质量，并且需要根据实际情况灵活调整，以达到高效、稳定、可控的生产目标。
花生根瘤菌的分离筛选及应用
54卷花生根瘤菌的分离筛选及应用杜普旋1，陈荣华2，邓权清1，鲁清1，刘浩1，范呈根2，李少雄1，洪彦彬1*（1广东省农业科学院作物研究所/国家油料作物改良中心南方分中心/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东广州510640；2赣州市农业科学研究所，江西赣州341000）摘要：【目的】分离筛选高效结瘤固氮的花生根瘤菌，为花生根瘤菌的田间推广应用提供理论依据和候选菌种。
【方法】采用植物捕获法从田间采集的土样中分离纯化根瘤菌，扩增其16S rDNA序列进行分子鉴定。
经回接试验和匹配试验筛选优良菌株及最佳共生组合，并通过土壤盆栽田间试验探究优良菌株的接种效果。
【结果】共分离纯化出15株花生根瘤菌，均属于α-变形菌纲的慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）。
回接试验筛选出2株共生固氮性状优良的花生根瘤菌GDHS-5和GDHS-14。
匹配试验表明这2个菌株具有广谱结瘤性，GDHS-5与粤油901的匹配效果最好，GDHS-14次之。
土壤盆栽条件下接种GDHS-5显著提高了粤油901的地上部分高度、根瘤数量和根瘤鲜重（P<0.05，下同），而接种GDHS-14与不接种对照（CK）无显著差异（P>0.05，下同）。
田间条件下接种GDHS-5分别使单株荚果数、产量和花生蔗糖含量显著增加35.82%、9.92%、165.88%，接种GDHS-14与CK无显著差异。
【结论】花生根瘤菌GDHS-5和GDHS-14共生固氮表现优异，其中GDHS-5能高效共生固氮，具有广谱结瘤性，在田间条件下可显著提高花生单株荚果数和产量，具有较大的田间应用潜力。
关键词：花生；根瘤菌；共生固氮；分离筛选中图分类号：S565.2；Q939.9文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）01-0102-08Isolation，screening and application of peanut rhizobiaDU Pu-xuan1，CHEN Rong-hua2，DENG Quan-qing1，LU Qing1，LIU Hao1，FAN Cheng-gen2，LI Shao-xiong1，HONG Yan-bin1*（1Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/South China Peanut Sub-center，National Cen-ter of Oilseed Crops Improvement/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Guangzhou，Guangdong510640，China；2Institute of Agricultural Sciences in Ganzhou，Ganzhou，Jiangxi341000，China）Abstract：【Objective】To isolate and screen peanut rhizobia of efficient nodulation and nitrogen fixation effects，and to provide theoretical basis and candidate strains for promotion and application of peanut rhizobia in field.【Method】Rhi-zobia were isolated and purified from soil samples collected in field by plant capture method，and their16S rDNA sequen-ces were amplified for molecular identification.Excellent rhizobia strains and optimal symbiotic combination were screened by reinoculation and matching tests，and effects of inoculation with the excellent strains were investigated through soil pot field tests.【Result】Fifteen strains of peanut rhizobia were isolated and purified，all belonging to Bradyrhi-zobium ofα-proteobacteria.Two strains of peanut rhizobia，GDHS-5and GDHS-14，with excellent symbiotic nitrogen fi-xation traits were screened through the reinoculation test.The matching test showed that these2strains had broad-spectrum nodulation，and matching Yueyou901with GDHS-5produced the best effects，followed by matching it with GDHS-14.Under soil pot culture conditions，inoculation with GDHS-5significantly increased above-ground part height，root nodule number and root nodule fresh weight of Yueyou901（P<0.05，the same below），but no significant difference was found be-tween strains inoculated with GDHS-14and non-inoculated control（CK）（P>0.05，the same below）.Pod number per plant，yield and sucrose content in peanut were significantly increased by35.82%，9.92%and165.88%respectively after inoculation with GDHS-5under field conditions，and no significant difference was found between strains inoculated with收稿日期：2022-10-20基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2022B020*******）；广东省科技计划项目（2021A0505030047）；广东省现代农业产业技术体系项目（2022KJ136-02）通讯作者：洪彦彬（1979-），https：///0000-0002-8589-8184，研究员，主要从事花生遗传育种研究工作，E-mail：hongyan-************第一作者：杜普旋（1996-），https：///0000-0002-5634-6225，主要从事生物固氮与菌植互作研究工作，E-mail：dupuxuan ************1期·103·0引言【研究意义】氮素是植物正常生长发育不可或缺的关键生命元素（杨正等，2021）。
豆科植物根瘤根瘤细菌的形态观察及其分离
豆科植物根瘤根瘤细菌的形态观察及其分离首先我们需要收集豆科植物的根瘤样品。
根瘤样品可以在有根瘤的植株上直接采集，或者从田间土壤中收集根瘤样品。
收集根瘤样品后，需要进行初步处理，将根瘤从植物根部分离出来。
可以用刀片小心地将根瘤切割出来，或者将整个根部与根瘤一起取下，随后用镊子将根瘤与根部分离。
分离出的根瘤细菌需要进行形态观察。
将分离出的根瘤样品均匀涂布在含有富集培养基的琼脂平板上。
富集培养基通常是一种富含营养物质的培养基，可以促进根瘤细菌的生长。
将琼脂平板置于恒温箱中，在适当的温度下培养一定时间，观察根瘤细菌的生长情况。
根瘤细菌的形态观察需要使用显微镜。
将根瘤细菌的培养物取出少量放在玻片上，并加入一滴脱色液。
用微量移液器将脱色液和细菌混合均匀，然后用载片将混合物涂在玻片上。
将玻片放在显微镜下观察细菌的形态特征，比如大小、形状、颜色等。
根瘤细菌的形态特征具有一定的多样性。
常见的根瘤细菌有球形、杆状和菌丝状等形态。
球形的根瘤细菌一般直径在0.5-1.5微米之间，杆状的根瘤细菌较为细长，一般长度为2-3微米，直径约为0.3-0.5微米。
菌丝状的根瘤细菌则具有分枝的特点，形状类似于真菌的菌丝。
根瘤细菌的颜色可以根据不同的染色方法进行观察。
一般可以使用常规的染色方法，比如革兰氏染色和分泌染色等。
革兰氏染色是一种常见的细菌染色方法，通过染色剂的作用可以使细菌的形态特征更加清晰可见。
分泌染色则是通过染色剂与细菌的分泌物反应，从而呈现出特定的颜色。
通过形态观察可以初步了解根瘤细菌的特征，但是为了进一步研究根瘤细菌的特性，还需要进行分离实验。
根瘤细菌的分离可以通过传代培养的方法。
将根瘤细菌接种到含有富集培养基的试管中，适当摇晃培养基，使根瘤细菌均匀分散。
培养一段时间后，再次从培养基中取出一部分分离根瘤细菌进行下一轮的培养。
经过多次传代培养后，可以得到纯种的根瘤细菌。
综上所述，豆科植物根瘤和根瘤细菌的形态观察及其分离是一项重要的实验工作。
实验十八豆科植物根瘤根瘤细菌的形态观察及其分离
实验程序Ⅰ
（观察豆科植物根瘤和根瘤细菌）
观察几种豆科植物根部根瘤的形状、色泽、以及 着生部位，识别有效根瘤和无效根瘤，或观察几 种豆科植物浸制标本的根瘤形状，并绘图。 观察根瘤细菌的形态：用镊子取根瘤1个，洗净后 放在洁净的载玻片上，加蒸馏水1滴，然后再用另 一洁净载玻片在这根瘤上轻轻压出根瘤中的汁液， 再取此汁液用接种环涂片，（亦可用分离到的根 瘤菌悬液涂片），用简单染色法染色，油镜下观 察并绘图。
实验十八
豆科植物根瘤、根瘤细 菌的形态观察及其分离
1/17/2019
豆科植物根瘤、根瘤细 菌的形态观察及其分离
目的要求
实验材料 实验程序 思考题
目的要求
观察几种豆科植物的根瘤和根瘤细菌的
形态。 掌握从根瘤中分离根瘤细菌的方法及培 养的方法
实验材料
不同豆科植物新鲜标本数株，不同豆科植物的浸 制标本。 加入结晶紫的根瘤菌培养基（10mL）。 无菌培养皿、接种环、1mL无菌水、2mL无菌水、 手术剪、无菌玻棒、载玻片、镊子、酒精灯、显 微镜、二甲苯、香柏油、擦镜纸。 0.1%升汞液。革兰氏染色液一套。
实验程序Ⅲ
（ 分离豆科植物根瘤菌）
取已融化的根瘤菌培养基以无菌操作制成平板（2付培养皿） 待用。 取上面已凝固的根瘤菌平板，用接种环在无菌操作下取一 环根瘤汁液进行分离（连续划线或分区划线）。 倒置28~300C培养。一般快生型根瘤菌（蚕豆、豌豆、苜 蓿、三叶草、紫云英根瘤菌）培养3—5d，慢生型根瘤菌 （大豆、花生、豇豆）培养7—10d即可长出菌落。 观察菌落形态，并进行描述；选取典型菌落进行涂片，革 兰氏染色，油镜下观察并绘图。将典型的单菌落转接到斜 面培养基上，得到根瘤菌纯种，用作菌种保藏。如不纯， 应再次划线分离。
郑州草坪白三叶草根瘤菌的分离与分子鉴定
摘要： ｔ 目的１ 为研究郑州市区草坪 白 三叶草根瘤菌的遗传多样性。【 方法】 实验采用包括 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ及 Ｉ Ｇ Ｓ Ｐ Ｃ Ｒ— Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ和
１ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ基 因序 列分析 方法。【 结果 】 该研 究从郑州 市 ４个 不 同采样 地点 的草坪 中采集 白Ｅ － 叶草根瘤 ， 并分 离得 到根瘤 菌
ｚ ｈ ｏ ｕ ． ［ Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ］ １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ ａ ｎ ｄ Ｉ Ｇ Ｓ Ｐ Ｃ Ｒ—Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ ａ ｎ ｄ １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ． ［ Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ］
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沙棘根瘤形态结构及根瘤细菌的分离鉴定
沙棘根瘤形态结构及根瘤细菌的分离鉴定沙棘根系可以与土壤中的弗兰克氏菌（Frankia）形成特殊的器官——根瘤,并在根瘤中有效固定大气中游离的氮（N<sub>2</sub>）。
然而,由于弗兰克氏菌的分离和培养异常困难,严重限制了相关的基础研究。
本研究利用现代显微技术对沙棘根瘤的形态结构、瘤瓣的解剖结构和根瘤内弗兰克氏菌的不同存在形式进行了观察;分别采集生长于陕西省永寿县马坊林场、安塞黄土高原试验站、靖边县五里湾和榆林市榆阳区转龙湾等4个沙棘林地的根瘤,采用根瘤切片法和匀浆法、在三种不同培养基上分离沙棘根瘤中的细菌;通过对菌株菌落形态的观察、生理生化指标的测定及16S rDNA序列测定等方法对分离到的菌株进行鉴定,以探讨沙棘根瘤细菌的多样性。
取得的结果如下:1.从沙棘根瘤的分布状况看,沙棘根系的结瘤数量并不高,只有少量一年生和二年生的根系上、偶尔在多年生的粗根上有根瘤的形成,且只出现在局部。
初生的根瘤是以单个瘤瓣出现,经多次二叉分枝后发育成珊瑚状瘤块,与桤木型根瘤相似。
2.根瘤瘤瓣的解剖结构表明,弗兰克氏菌侵染的部位主要集中在外皮层和中皮层的外侧区域的细胞,中皮层的内侧区域和中柱内被侵染的细胞相对较少。
从侵染细胞与非侵染细胞相间出现的现象及其各自的特征可以看出,根瘤的不同宿主细胞抵抗弗兰克氏菌侵染的能力不同;而弗兰克氏菌侵染宿主细胞后,就会以菌丝体、泡囊和孢子囊三种不同的形式存在。
3.根据菌株的菌落形态、生理生化指标以及16S rDNA序列测定结果,参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）,可将从马坊、安塞、五里湾和转龙湾等四个林地沙棘根瘤中分离到90株菌,归类到4个门7个纲14个目20个科27个属。
其中,从马坊林地沙棘根瘤分离得到52株菌,属于4门6纲12目19科26属,以小单孢菌属、芽孢杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的菌株最多;从安塞地区沙棘根瘤分离得到的5株菌归属于3门3纲3目3科3属,分别为链霉菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属;从五里湾林地沙棘根瘤分离得到5株菌,属于2门2纲2目3科3属,分别为小单孢菌属、两面神菌属和芽孢杆菌属;从转龙湾林地沙棘根瘤分离得到的28株菌属于3门4纲5目5科6属,分别为小单孢菌属、Plantactinospora、放线异壁酸菌属、Hungatella、芽孢杆菌属和鞘氨醇单胞菌属。
草学概论根瘤菌实验报告
一、实验目的通过本实验，了解根瘤菌的生物学特性，掌握根瘤菌与豆科植物共生固氮的原理，以及根瘤菌的分离、纯化、鉴定方法。
同时，通过实验操作，提高学生的实践操作能力和科学思维能力。
二、实验原理根瘤菌是一种与豆科植物共生固氮的细菌，能够将大气中的氮气转化为植物可吸收的氨态氮，为豆科植物提供氮素养分。
根瘤菌与豆科植物共生形成根瘤，根瘤菌在根瘤中生长繁殖，固定氮气，而豆科植物则为根瘤菌提供生长所需的营养物质。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大豆种子、土壤、根瘤菌、酵母提取物、葡萄糖、琼脂等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、无菌操作台、无菌试管、接种环、培养皿等。
四、实验方法1. 根瘤菌的分离与纯化（1）将土壤样品进行稀释，分别涂布于含有大豆种子汁液的固体培养基上。
（2）将培养皿置于恒温培养箱中，37℃培养3-5天。
（3）挑取单菌落，进行纯化培养。
2. 根瘤菌的鉴定（1）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘等。
（2）进行革兰氏染色，观察细菌的形态。
（3）进行芽孢染色，观察细菌是否有芽孢。
（4）进行氧化酶试验，观察细菌是否产生氧化酶。
3. 根瘤菌与豆科植物共生固氮实验（1）将分离纯化的根瘤菌接种到大豆幼苗的根际土壤中。
（2）定期观察大豆植株的生长状况，测定其氮含量。
（3）比较接种根瘤菌与未接种根瘤菌的大豆植株的氮含量差异。
五、实验结果与分析1. 根瘤菌的分离与纯化通过涂布分离法，成功分离出一株根瘤菌，菌落呈白色，边缘整齐，表面光滑。
2. 根瘤菌的鉴定通过观察菌落特征、革兰氏染色、芽孢染色和氧化酶试验，初步鉴定该根瘤菌为革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阳性的细菌。
3. 根瘤菌与豆科植物共生固氮实验接种根瘤菌的大豆植株生长旺盛，叶片绿色，氮含量显著高于未接种根瘤菌的大豆植株。
六、实验结论1. 成功分离出一株根瘤菌，并通过实验鉴定出该菌为革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阳性的细菌。
2. 根瘤菌与豆科植物共生固氮，为豆科植物提供氮素养分，有利于豆科植物的生长。
泡桐根瘤内生细菌的分离及初步鉴定
泡桐根瘤内生细菌的分离及初步鉴定丁玮;吕成群;黄宝灵;李昆龙;陈振飞;任涵;康凯【摘要】[目的]为了探究非豆科植物泡桐与微生物共生固氮体系,对泡桐根瘤内生细菌的分离培养条件及其系统发育地位进行初步研究.[方法]对从广西钦州市采集的泡桐根瘤上分离纯化得到的根瘤内生细菌,进行传统生理生化研究和16S rDNA系统发育分析.[结果]经分离纯化得到9株根瘤内生细菌,大部分菌株能较好地利用8种碳源;78％的菌株能利用铵盐,89％的菌株能利用硝酸盐;所有的供试菌株在3-酮基乳糖和淀粉水解试验中呈阴性;89％的菌株能利用柠檬酸盐;B.T.B反应除菌株PG-7产碱外,其余都产酸;33％的菌株能使硝酸盐还原;有56％的菌株能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好,多数菌株具备豆科植物根瘤菌的一般生理生化特征.通过16S rDNA全序列分析,确定9株供试菌株可分为4个菌属,其中菌株PG-1和PG-2共属于土壤杆菌属(Agrobacterium),PG-3、PG-5、PG-6、PG-8和PG-9等5株菌株共属于根瘤菌属(Rhizobium),PG-4隶属于草螺菌属(Herbaspirillum),PG-7隶属于伯克氏菌属(Burkholderia).[结论]分离自同一寄主的根瘤内生细菌其生理生化特性方面存在较大的差异性,同时表现出了遗传的多样性.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2019(046)001【总页数】7页(P36-42)【关键词】泡桐;根瘤内生细菌;生理生化特性;16SrDNA全序列分析【作者】丁玮;吕成群;黄宝灵;李昆龙;陈振飞;任涵;康凯【作者单位】广西大学林学院,广西南宁 530004;广西大学林学院,广西南宁530004;广西大学林学院,广西南宁 530004;广西绿桐林业科技有限公司,广西南宁530028;广西绿桐林业科技有限公司,广西南宁 530028;广西大学林学院,广西南宁530004;广西大学林学院,广西南宁 530004【正文语种】中文【中图分类】S792.43;Q939.1【研究意义】泡桐（Paulownia）为玄参科（Scrophulariaceae）泡桐属（Paulownia）落叶乔木，原产中国，在国内25个省（市、区）有自然分布，是我国栽培历史最悠久的树种之一［1-3］。
周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定
关键词 ： 大豆 ； 根瘤 菌； 同接 鉴 定 ； 费式 中 华根 瘤 菌 中图分类号 ： ￥ ４ ３ ２ ． ４ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ０— ７ ０ ９ １ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ４— ０ ０ ９ ８— ０ ５
ｄｏｉ． １ ０． ７ ６６ ８／ ｈｂ ｎｘ ｂ． ２ ０１ ７． ０ ４． ０１ ６
ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｒ ｈｉ ｚ ｏ ｂ ｉ ｕ ｍ ｏ ｆ ｓ ｏ ｙ ｂ ｅ ａ ｎ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｆ ｏ ｒ ｍ ｎ ｏ ｄｕ ｌ ｅ ｓ ｉ ｎ ｓ ｏ ｙ ｂ ｅ ａ ｎ ａ ｎ ｄ ａ ｌ ｆ ａ ｌ ｆ ａ ． Ａｃ ｃ ｏ ｒ ｄｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈｅ ｐ ｕ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ｓ ｏ ｙ ｂ ｅ ａ ｎ ｒ ｈ ｉ ｚ ｏ —
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２ ０１ ７， ３ ２（ ４）： ９ ８— １ ０ ２ ｎ 日 Ｒ Ｉ Ｃ Ｕ Ｌ Ｔ Ｕ Ｒ Ａ Ｆ ． 华 北 农 学 报 ・ Ｂ Ｄ 脏ｄ ｉ Ｌ ｌ － ￥ １ ｎ ｌ Ｃ Ａ
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周 口地 区 大 豆 根 瘤 菌 的 分 离 与 分 子 鉴 定
张 怡 ， 张 超 ， 杨 艳 杰 ， 于 洁 蒙 ， 季 慧佳 ， 陈 红 ，
据 已公 布 大 豆 根 瘤 菌 共 同结 瘤 基 因 ｎ ｏ ｄ Ａ、 ｎ ｆ ｉ Ｈ、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ保 守 区域 设 计 引 物 ， 并且对 ｎ ｏ ｄ Ａ、 ｎ 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序列进 ， 彳 扩 增 分析和系统发育分析 ， 由此 鉴 定 分 离 的根 瘤 菌 为 费 式 中华 根 瘤 菌 ， 从 而 在 分 子 水 平 上 实 现 丁 对 大 豆 根 瘤 菌 的快 速
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L/O/G/O
采集
(1) 照相 (2) 挖掘和根瘤保存
根瘤选取：大个、新鲜、粉红色、尽量多取。 根瘤采集：1.主根上可以剥取少量根皮以保证根瘤完整。 2.侧根上的可带少许根。
采集
农大豆2号
保豆3号
保存
稀释2万倍
稀释100万倍
保菌
使用YMA液体 +20%甘油，吹 打斜面上的菌， 吸取保存。 使用YMA液体 +20%甘油，吸 取摇好的单个菌 斑菌液。
提取基因组DNA
260/280:1.97
260/230:2.02 浓度：570ng/μl
每个单株植物 的根瘤收集在一个 卫生纸包中，每个 采集点的多个植株 放在一个装有硅胶 的自封袋中。
分离及纯化
1. 用无菌水浸泡干燥根瘤菌直至其复原。 2 .用95%的酒精浸泡3~5分钟，用5%的NaClO3 浸泡1分钟， 用无菌水清洗 5~7次（换水）。（在超净台上操作， 并且在酒精灯附近，防止染菌）
鉴定
16S rDNA序列测定：方法同书。 其中：dNTP：2.5mm 引物：10μm 测序后，在NCBI blast 中进行比对， 一般情况下，相似性能达到99%左右。
分离及纯化
消毒
刺破
划线
分离及纯化
4.待平板出现菌落后，观察，选取目的菌落再 次划线纯化，镜检。 5.纯化后的菌划线在试管斜面培养基上，供保 菌。
分离及纯化
稀释1万倍
挑菌，摇菌
分离及纯化
(1) 根瘤浸泡
(2) 根瘤消毒
分离及纯化
3.用牙签（灭菌时尖头朝上，平头朝下）的平
头端在灭菌的玻璃平皿上将根瘤刺破（必要时可以 滴加一滴无菌水）。用灭菌接种环蘸取菌液在YMA 固体培养基上划线。Байду номын сангаас灭菌接种环蘸取同种菌液， 在载玻片上进行革兰氏染色，镜检。