哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
哺乳动物细胞重组蛋白工程
哺乳动物细胞重组蛋白工程
哺乳动物细胞重组蛋白工程是一种利用哺乳动物细胞来合成重组蛋白的技术。
该技术可以生产大量纯化的重组蛋白，用于研究和临床应用。
哺乳动物细胞重组蛋白工程一般分为以下几个步骤：
1. 选择合适的宿主细胞：常用的宿主细胞包括CHO（Chinese Hamster Ovary）细胞、HEK（Human Embryonic Kidney）细
胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因（编码所需蛋白的基因）插入到合适的表达载体中，并加入适当的启动子、增强子和终止子等元件。
3. 转染和筛选：将构建好的表达载体导入到选择的宿主细胞中，通常使用转染技术（如电穿孔、化学转染等）将表达载体导入宿主细胞，然后通过筛选（如抗生素筛选）获得成功转染的细胞。
4. 表达和培养：将成功转染的细胞进行培养，提供适宜的培养基、温度和气体条件等，促使细胞表达目标蛋白。
5. 纯化和分析：通过细胞培养产生的蛋白，经过一系列纯化步骤（如离心、层析、过滤等），得到高纯度的重组蛋白。
同时，还需要对蛋白进行功能和结构的分析，确保其质量和活性。
哺乳动物细胞重组蛋白工程的优势包括生成更多的细胞因子和复合蛋白、较高水平的糖基化和蛋白修饰等。
然而，与原核表达系统相比，哺乳动物细胞重组蛋白工程的成本较高且时间较长。
利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展
利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成为成熟的mRNA，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后加工过程，因而产生的完整抗体和天然抗体一样，具有生物学活性，既可识别抗原又可激活补体系统。
哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有遗传稳定性和可重复性．表达的产物分泌到培养基中易于纯化。
利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、和生长因子等的大量制备。
1．哺乳动物细胞宿主的选择哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。
产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。
不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA 的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。
已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势蛋白质是生命机体中最重要的组成部分之一，在生物学、医学和工业领域都具有广泛的应用。
蛋白质表达则是将基因信息转化为蛋白质的过程，这一过程对于基础研究和工业化生产都具有重要作用。
在动物细胞中，蛋白质表达利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质具有一系列优势。
一、哺乳动物细胞表达的优势哺乳动物细胞是表达重组蛋白质的理想载体，其优势主要有以下几点：1.真核生物中的哺乳动物细胞能够在所有重组蛋白质修饰过程中提供最高水平的质量。
由于哺乳动物细胞在体内合成蛋白质时，可以发生多种复杂的修饰过程，例如酰化、糖基化和磷酸化等。
这些修饰可以提高蛋白质的稳定性、可溶性和生物活性，使重组蛋白质更加适合用于医学和工业方面。
相比之下，原核生物（如大肠杆菌）表达的蛋白质缺乏这些修饰过程，因此其生物活性和稳定性较低。
此外，哺乳动物细胞中的重组蛋白质也很少产生抗原性，因此更适合用于医学应用。
2.哺乳动物细胞中的蛋白质折叠和修饰过程更加类似于人类和其他哺乳动物中蛋白质合成的过程。
由于哺乳动物细胞与人类和其他哺乳动物有很大相似性，因此表达的重组蛋白质更符合人类进化历史和生物学功能。
这也意味着可以更好地预测重组蛋白质在生理环境下的稳定性和效力，缩短临床试验的时间和成本。
3.哺乳动物细胞表达的重组蛋白质能够以天然状态的形式分泌到培养基中。
重组蛋白质如果能够以天然状态的形式分泌到培养基中，可以节省纯化步骤和工艺流程，降低生产成本，提高重组蛋白质的产量和纯度。
而哺乳动物细胞中的重组蛋白质通常能够实现这一点。
此外，哺乳动物细胞的培养和维护工艺已经比较成熟，使用更加方便。
二、哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法有多种，主要有以下几种：1.哺乳动物细胞内表达哺乳动物细胞内表达是将重组质粒导入哺乳动物细胞内部，利用细胞自身的基因转录、转译和修饰等机制，表达出重组蛋白质。
分子生物学技术在医药领域的应用及其研究进展
分子生物学技术在医药领域的应用及其研究进展随着科技的不断进步和发展，分子生物学技术被广泛应用于医药领域，并为之带来了革命性的突破。
在过去的二十年里，分子生物学技术在医药领域的研究和应用不断深入，为了更好地掌握这些技术及其在医药领域的运用，本文将着重介绍分子生物学技术在医药领域的应用及其研究进展。
一、 DNA-技术1. DNA-定向克隆技术DNA-定向克隆技术作为最早发展起来的一种生物技术，被广泛应用于医药领域。
通过引入外源DNA分子，可以实现对基因结构和表达进行研究，并出现了许多生物疗法，如基因治疗。
2. DNA-测序技术DNA-测序技术是现代分子生物学技术中最为重要的一项，也是在医药研究中应用最为广泛的一种技术。
这个技术被广泛应用于相关理论和研究，为研究如基因遗传、人类统计发病率等方面提供了非常重要的基础。
二、蛋白质-技术1. 蛋白质表达技术为了对蛋白质进行研究，蛋白质表达技术在医药领域被广泛应用。
在蛋白质表达的最初阶段，使用的细胞主要是大肠杆菌等细菌，并在不断改进后，也开始应用哺乳动物细胞来生产蛋白质，进而科研人员可以通过克隆技术、改造技术进行相关实验分析。
2. 蛋白质结构研究技术蛋白质质量的研究在医药领域也有广泛的运用。
其中最应用最广的是X射线晶体学技术，它可以帮助研究者找出3D结构，并进而推测出分子的工作原理。
该技术在药物开发中逐渐变得重要，因为药物的疗效往往可以依赖于分子相互作用的性质。
三、细胞生物学技术1. 细胞培养技术细胞培养技术是对细胞实验室中进行研究的最基本方法之一。
在医学领域内，细胞培养技术主要用于制造生物学治疗药物，如血液制品，癌症疫苗等等。
2. 细胞基因工程技术细胞基因工程技术是对基因进行改变的一种科技手段，广泛应用于外源基因表达研究。
这种技术可以大幅度提高人体细胞对负荷压力的耐力等等。
四、发展趋势和展望现代的分子生物学技术得到了快速的发展，例如高通量DNA 测序、CRISPR基因修饰、单细胞测序技术，使得分子生物学技术向更为深入的领域拓展，例如个性化医疗和靶向治疗，因此在医药领域的应用前景可以展望得非常美好。
生物制药的发展
生物制药的发展生物制药是利用生物技术和生物工程技术生产药品的过程，它使用生物体（如细菌、真菌和哺乳动物细胞）来产生具有治疗功能的药物。
自从人类掌握了基因工程和细胞培养技术以来，生物制药行业取得了长足的发展。
本文将从过去、现在和未来三个时间段来介绍生物制药的发展。
过去在过去，制药行业主要依赖于化学合成方法生产药品，这种方法对于许多复杂的生物药物来说非常困难。
然而，随着基因工程技术的突破，人们开始尝试利用生物体来合成药物。
第一种生物制药品是1982年上市的人类胰岛素，它是通过大肠杆菌进行合成的。
这个突破标志着生物制药行业的开始，也开创了人类疾病治疗的新篇章。
从那以后，越来越多的药物开始采用生物制药的方式生产。
现在在现代，生物制药已经成为制药行业的重要部分。
许多重要的药物，如乙肝疫苗、重组人胰岛素和抗体药物等，都是通过生物制药技术来生产的。
生物制药的主要过程包括基因克隆、细胞培养、蛋白质纯化等步骤。
首先，使用基因工程技术将目标基因导入到合适的宿主细胞中，然后进行细胞培养，让细胞合成所需的蛋白质。
最后，通过蛋白质纯化技术可以提取纯度较高的生物制药产品。
这种生产方式不仅能够大量生产药品，而且能够确保药品的质量和纯度。
未来随着科技的不断进步，生物制药行业面临着巨大的发展机遇。
首先，基因编辑技术的突破将使得生物制药更加高效和精确。
科学家可以通过编辑细胞的基因组来使其产生更多或更好的药物。
其次，干细胞技术的发展有望为生物制药提供更多的来源。
干细胞可以分化成各种类型的细胞，因此可以用于合成不同类型的药物。
此外，纳米技术的应用也将使得药物输送更加精确和高效。
纳米颗粒可以将药物精确地输送到病变部位，从而提高药物的疗效。
总结生物制药的发展为人类健康事业带来了巨大的贡献。
它使得许多传统药物变得更加可行，同时也推动了许多新药物的产生。
随着科技的进步，生物制药行业还将迎来更多的机遇和挑战。
我们对生物制药技术的不断探索和创新将为人类的健康提供更多可能。
蛋白质药物的研发与实践
蛋白质药物的研发与实践蛋白质药物是指以生物大分子蛋白质作为原料研发出来的药物，是一种新型的生物制品。
与传统的小分子化学药物相比，蛋白质药物具有多样化、高度特异化、高活性、低毒副显著特点，已经在肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染等疾病的治疗中发挥着重要的作用。
但是，蛋白质药物的研发与实践仍然面临着许多挑战。
一、蛋白质药物的制备方法目前，制备蛋白质药物的方法主要有两种，分别是基因重组技术和杂交瘤技术。
基因重组技术是将所需的蛋白质基因克隆至表达载体中，进而可以通过对细胞培养，获得蛋白质药物。
而杂交瘤技术则是将人类B细胞与鼠咪细胞杂交，制备出具有自身免疫性质的单克隆抗体，从而研制出相应的蛋白质药物。
基因重组技术由于其克隆、高效率、高纯度的特点，成为了最常见的制备蛋白质药物的方法。
然而，有些蛋白质药物的自然结构和功能十分复杂，仍存在困难和挑战。
二、蛋白质药物的设计和表达蛋白质药物的设计要考虑其目标生息体和作用环境，尤其是在生产过程中的稳定性等问题。
同时，制备过程中，要确保蛋白质药物的高表达率和高纯度，从而可以保证药物的效果和安全性。
其中，重要的一步就是表达系统的选择。
经过研究，大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等都被广泛应用于表达蛋白质药物。
酵母是一种单细胞微生物，具有快速、高效而且易于操纵等特点，可快速生成重组蛋白质。
大肠杆菌是生产生物药物中的一种不可或缺的细胞工厂，因为其生长速度快、培养条件简单、高效而且成本低。
而哺乳动物细胞则可以免疫调节和修饰蛋白质分子，使其结构和生物活性更加稳定。
三、蛋白质药物的保护与贮存蛋白质药物的质量和稳定性受到许多因素的影响，包括环境温度、酸碱度、重金属等。
因此，在保护和贮存蛋白质药物时要注意以下几点：1. 储存条件：蛋白质药物最好在0℃下保存，保持稳定性。
2. 冻干处理：冻干处理可以去除蛋白质药物中的水分，从而减少氧化和降解的可能性。
3. 包装材料：包装材料要选择透气性好、不起静电的材料，以避免静电影响药效和稳定性。
细胞工程制药的研究进展及展望
第2期2021年4月No.2April，20211 生物制药及细胞工程概述生物制药是生物技术的综合利用，从生物体、生物组织、细胞和体液中分离出有效成分，制备用于预防、治疗和诊断的产品[1]。
天然的生物材料赋予了生物制药安全性高、副作用小、营养价值较高的特点，这些显著的优势使生物药物越来越受人们的青睐，这也是生物药物市场不断扩大的重要原因之一。
细胞工程是以细胞为研究对象，按照需求利用细胞和分子生物学的理论设计和操作，使细胞在遗传学上的特性发生变化，达到改良或创造新品种的目的，在大规模地培养和繁殖后，最终提取出对人类有利的产品。
在工业上，主要包括上游工程（包括细胞培养、遗传操作和保存）和下游工程（包括转化细胞在生物制品生产中的应用）[2]。
如今，细胞工程在生物制药工业发挥着不可替代的作用。
2 动物细胞工程制药2.1 动物细胞工程制药的概述及早期发展动物细胞工程制药最早能够追溯到20世纪50年代，用动物细胞生产病毒，也就是在生物反应器中培养动物细胞，进行大规模培养后，再接种减毒或灭活的病毒来生产疫苗[3]。
常见的动物细胞培养技术流程，一般是先将动物组织分散成单个细胞、细胞群（团）后，接种于培养基中进行原代培养，再经过10~50代的传代培养，就初步得到了需要的细胞系。
然而，由于自然界的细胞普遍表达水平低，通过这种方法生产的产品不仅产量低，而且成本高，因此，早期动物细胞培养并没有得到充分的重视。
2.2 杂交瘤技术杂交瘤技术在20世纪70年代的创建，是动物细胞技术发展新的里程碑。
随着杂交瘤技术在工业领域的应用，各种新产物相继出现，在生产用于疾病诊断和治疗的生物制品中具有重要意义[3]。
1984年的诺贝尔生理学或医学奖颁给了创立抗原选择抗体学说以及发明单克隆抗体技术的3位科学家。
他们提出将能够分泌特异性抗体的B 淋巴细胞与能够无限增殖的骨髓瘤细胞融合筛选，形成能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
这种方法得到的融合细胞可以稳定生产特异性强、效价高的单克隆抗体。
哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展
哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展随着动物细胞培养技术的不断改进，灌注培养体系以其特有的优势取得了广泛的发展。
本文依据不同灌注培养系统的特点划分分为微载体悬浮灌注培养、悬浮细胞截流灌注培养、流化床及固定床灌注培养等几类，并对各类型的灌注体系进行了概述。
【关键词】灌注培养；微载体；细胞截留随着单克隆抗体药物产业的发展，带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高。
利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药企业的发展方向。
在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。
在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。
灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。
1 悬浮灌注培养1.1 微载体悬浮灌注培养微载体培养最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在细胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养，借助搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。
近年来随着对微载体材料的深入探索，相继开发出液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体已进行商业化生产，如明胶微载体Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore 等。
1.2 悬浮细胞截流灌注培养随着无血清悬浮培养技术的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，但是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。
该工艺的重点在细胞截流上，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为焦点。
哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
天然蛋 白质相似的特性而取得 了重要应用。从蛋 白质药物制造技 术发展来看， 考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋 白质药物质量 较 高， 并且制备过程难度低、 制备成本不高， 由此决定了哺乳动物细胞培 养制备充足蛋 白质药物将在未来的制药领域取得全 面发 展和应用。基于这一认识 ， 我们应认真总结哺乳动物 细胞培养制备 充足蛋白质药物取得 的进展 ， 并深入探讨哺乳动物细胞培养制 备 充足 蛋 白质 药物技 术 的 发展 前 景 ， 做好 哺 乳 动物 细 胞培 养 制备 充 足蛋 白质 药物 的 研制 工作 。 关键词 ： 哺乳动物细胞； 培养制备 ； 充足蛋 白质药物 ； 进展分析
１前 言 重复序列。 近年来新发现 的强启动子如人编在蛋 ￣ ｔ （ ｕ ｂ ｉ ｑ ｕ ｉ ｔ ｉ ｎ ） Ｃ基 因 在 近 年生 物 制药 发 展 中 ， 利 用 哺乳 动 物 细 胞 培养 制 备 充 足蛋 白 启动子 以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高 的活性 ， 而且具 质 已经 成 为 了重 要 的发 展 方 向。研 究 表 明 ， 哺 乳 动物 细 胞 培养 制备 有 更广 阔的 宿主 细胞 范 围 。 的 蛋 白质 ， 无 论是 在 制 备质 量 上 ， 还 是 在 蛋 白质 含 量 上 ， 都 达 到 了药 上述研究表 明， 不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化 用标 准 ， 并 且 在性 能 上 也 与 天然 蛋 白质较 为接 近 。基 于这 一 优 势和 表达载体 、提高蛋 白质药物在哺乳动物细胞中表 达量 的不变 的方 特点， 关于哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物的研究得到 了有效开 向 。 展， 并 取得 了积极 的研 究效 果 。结 合 目前 关 于 哺 乳 动物 细 胞 培 养制 ４ 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在生物制备过程 中取得 备充足蛋 白质药物的现状 ， 该 研究 在重组细胞系 、 重组表达载体和 的进 展 生 物 制备 过 程 中取 得 了积 极 进 展 。 哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在 生 ２哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在重组细胞系 中取得的 物反应器中进行的单细胞悬浮式培养 ， 反应罐的体积可达 ２ Ｏ 吨。 为 进 展 了节 约成本 ， 减少动物血清对产 品的污染 ， 现在主要采用无血清培 Ｃ Ｏ Ｓ 细 胞 曾是 进行 外 源 基 因表 达研 究 中用 途 最广 的宿 主 ， 但由 养基 ， 目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的 于 其 严重 的贴 壁作 用 ， 限制 了大 规模 悬 浮 培 养 的实 际应 用 。 目前 哺 无血清培养基 ， 如Ｕ ｌ ｔ ｒ ａ Ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ， Ｐ ｍＣ Ｈ Ｏ， Ｐ ｒ ｏ ２ ９ ３ 等。 乳 动 物 细 胞生 产 重 组 蛋 白中 ，常 用 的 细胞 系有 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３两 考虑到制药过程的现实需要 ， 提高生物制备能力是保证蛋 白质 大类细胞 。 Ｃ Ｈ Ｏ是 目前生物工程上广泛使用的细胞 。 该细胞属于成 药物制备取得实效的关键 。从 目前的研究过程来看 ， 提高生物制备 纤维细胞 ， 本 身 很 少 分 泌 内源 蛋 白 ， 因此 对 目标 蛋 白分 离 纯 化 工 作 能 力 的研 究 成果 主要 表 现在 以下 几个 方 面 ： 十分 有利 ， 是 表 达 复 杂生 物 大 分 子 的理 想 宿 主 。工 业 生 产 上应 用 较 ４ ． １培养方式可以为单细胞悬浮式培养 。 这样可以减少培养基， 多 的是 Ｃ ＨＯ — Ｋ１ 细胞 及 Ｃ Ｈ Ｏ ／ ｄ ｈ ｆ ｒ 一 细胞 ， 被 广 泛 地用 于 重 组 Ｄ Ｎ Ａ蛋 提高培养效果， 降低培养过程成本。 白的稳定表达生产。 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３细胞是转染腺病毒 Ｅ １ Ａ基因的人肾上 ４ ． ２反应罐的体积可以达到 ２ ０ 吨以上。 现有的培养实验将反应 皮 细胞 系 ， 它易于转染 ， 是 一 个 很 常 用 的 表 达研 究 外 源基 因 的 细 胞 罐的体积设定在 ２ Ｏ 吨， 并取得 了良好的培养效果。因此在蛋 白质制 株。利用瞬时基因表达方法 ， 采用悬浮培养系统 ， 可以快速 、 方便地 备过程 中， 可以根据实际需要扩大反应罐 的体积 ， 满足蛋白质制备 获 得 ｍｇ 级蛋 白。 需要 。 目前 还 有 一 些 哺 乳 动 物 细胞 株 正 在进 行 大 规模 培 养 生 产 的 研 ４ ＿ ３培养中使用无血清培养基 。 既降低培养基成本 ， 又减少了血 发中 ， 如来源于 Ｍａ ｄ Ｉ ｉ ｎ — Ｄ ａ ｒ ｂ ｙ 犬 肾的高分化 内皮 细胞株（ Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ １ 、 红 清中动物成分的污染可能。 系细胞株 、 以及人的胚胎干细胞等 。由于不同重组细胞系表达 的重 ５ 结束 语 组蛋白其稳定性和糖基化类型不同 ， 需要根据 目的蛋 白选择最佳的 通过本文的分析可知 ， 结合生物制药 的研究与发展形势 ， 哺乳 重 组 细胞 系 。 动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能 ， 从目 前 的研究 从上述研究成果来看 ， 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药 物在重 来看 ， 哺乳动物细胞培养制备充足蛋 白质药物取得了积极进展 ， 在 组细胞 系中取得了积极进展 ，其产生的影 响主要表现在两个方面 ： 重组细胞系、 重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突 哺乳动物细胞系 的分类越来越清晰 ， 主要分为 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｉ － Ｉ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ 破 。为此 ， 我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物
生产单克隆抗体的动物细胞无血清培养工艺研究进展
生产单克隆抗体的动物细胞无血清培养工艺研究进展自从20世纪90年代以来，全球生物制药研究得到快速发展，产生了抗体药物、基因工程药物、诊断试剂、疫苗以及血液制品等五大类生物技术药物。
目前每年都有300-500种生物药进入临床试验，远远超过小分子化学药物的研发速度，是当前最活跃的医药研发领域[1]。
近年来，通过动物细胞培养技术表达重组蛋白成为生物制药的主要发展趋势，其中单克隆抗体类药物占重要地位，在医学研究及临床治疗中应用广泛，具有重要的社会意义和经济价值。
1动物细胞培养生产单克隆抗体的研究概况1.1动物细胞培养技术的发展动物细胞体外培养从1885年Roux等人进行鸡胚胎组织培养开始，20世纪50年代人类对病毒疫苗的大量需求促进人们大规模培养哺乳动物细胞，并开始生产工艺过程设计研究[2]。
1975年B淋巴细胞杂交瘤技术的问世，以及后来的基因重组技术在生物制药中的应用，分别掀起了动物细胞大规模培养技术研究的两次高潮，最终获得能够稳定表达重组蛋白的哺乳动物细胞,使其在生命科学的各个领域中发挥着重要作用[3]。
哺乳动物细胞具备完整的转录翻译系统，保证重组蛋白（特别是抗体）在表达过程中准确进行复杂的翻译后修饰，包括多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化等，而正确进行翻译后修饰是重组蛋白具有生物学活性的前提条件[4,5]。
哺乳动物细胞表达的重组蛋白最接近人源蛋白质，与天然蛋白有最大的相似性, 使其成为蛋白类生物产品的理想宿主细胞。
早期的哺乳动物细胞系生产能力远比不上基因工程菌，但目前已有文献报道培养哺乳动物细胞生产重组蛋白的最终浓度达到3-13 g/L，生产能力大大提高[6,7]。
总的来说，哺乳动物细胞相对于生产重组蛋白的基因工程菌（不能进行糖基化等翻译后修饰的原核生物）仍然具有优势，对于保证蛋白产品的质量具有重要意义。
1.2单克隆抗体药物的发展趋势和面临的问题单克隆抗体有“生物导弹”之称，已经广泛应用于多个医学领域，包括疾病诊断，自身免疫病和癌症的治疗。
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗摘要动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。
动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。
对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。
本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。
研究背景动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。
1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。
法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。
流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。
由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。
20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。
进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。
2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。
蛋白质表达与纯化技术的研究进展
蛋白质表达与纯化技术的研究进展随着生物技术的发展，蛋白质表达与纯化技术也得到了迅速的发展。
蛋白质是生命物质中至关重要的组成部分，为研究生命的机制及开发生物制药提供了重要的基础和前提。
本文将从蛋白质表达及纯化技术的研究进展入手，介绍相关的前沿技术和方法。
一、蛋白质表达技术的研究进展1.1 原核表达系统原核表达系统是一种常用的蛋白质表达技术，它利用细菌的生物学特性，在大规模表达目标蛋白质的同时，具有快速、高效、经济的优势。
近年来，原核表达系统也得到了不断的改良和优化，例如利用基因工程技术将目标蛋白质表达的速度和表达量得到了显著提高，进一步拓宽了其应用范围。
1.2 酵母表达系统酵母表达系统主要利用酵母菌作为载体表达目标蛋白质，具有高表达量、合成质量好、能够进行翻译后修饰等优点。
在酵母表达系统中，利用选择性培养基的筛选方法可以显著提高目标蛋白质表达的效率和纯度。
1.3 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，利用昆虫细胞（如Sf9、Sf21细胞等）表达目标蛋白质。
这种系统具有易于维护，表达效率高，重组蛋白质具有天然的哺乳动物的修饰等优点。
目前，昆虫细胞表达系统已经被广泛应用于疫苗、生物药物等领域。
1.4 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前最常用的蛋白质表达技术，通过利用哺乳动物细胞表达目标蛋白质并进行不同程度的修饰，可以得到与天然蛋白质相似的重组蛋白质。
此外，该系统还可应用于细胞培养技术、生物药物研发等领域。
二、蛋白质纯化技术的研究进展2.1 柱层析技术柱层析技术作为蛋白质纯化的核心技术，是一种能根据其化学性质和物理性质特征，利用不同的色谱柱实现组分分离的技术。
随着柱层析技术的发展，液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等技术的出现，蛋白质的纯化程度得到了进一步提高。
2.2 薄层凝胶电泳技术薄层凝胶电泳技术是一种以物质的分子量为分离基础，利用电泳原理实现生物大分子分离的技术。
哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展
哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展李潜 张彩乔 侯丽媛 张卫婷【摘要】 在生物制药行业, 哺乳动物细胞培养系统, 尤其是主要是用于生产糖蛋白药物的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞应用最为广泛。
蛋白质糖基化可以影响工业化糖蛋白药物的活性, 因此糖基化是重组糖蛋白药物的重要质量属性。
糖蛋白药物糖基化水平的稳定性尤其需要关注, 碳水化合物结构将会决定的分子类型。
最佳的糖蛋白药物就是拥有治疗效果或者筛选出同类的糖蛋白。
通过调节哺乳动物细胞培养条件, 如改变细胞株, 培养基成分和过程控制等影响因素。
生产融合蛋白或者单克隆抗体的生物过程变量和糖蛋白药物质量有着错综复杂的联系, 糖基化程度的优化将会提高产品功效。
本文重点讨论在工业化生产中通过过程控制提升糖基化水平, 并依此了解如何控制糖蛋白药物糖基化水平。
【关键词】 生物工艺；哺乳动物细胞培养；蛋白糖基化；糖蛋白药物；蛋白质量DOI ：10.14164/11-5581/r.2017.14.112·综述·作者单位：050010 华北制药金坦生物技术股份有限公司蛋白糖基化对于蛋白疗效及糖蛋白的生产至关重要。
商业化生产糖蛋白药物首选哺乳动物表达系统, 因其具有天然蛋白加工机制, 包括蛋白糖基化, 这样就与天然的蛋白十分接近, 并保证治疗效果。
蛋白质糖基化的形成主要是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链(N-连接)或者连接到丝氨酸/苏氨酸(O-连接)。
多糖会影响糖蛋白药物活性, 同时也会并决定该糖蛋白药物在体内的半衰期［1］。
正是因为其特点, 糖蛋白药物糖型需要满足药品监管部门的要求规范, 以确保其有效性和安全性。
1 蛋白糖基化控制在细胞培养过程控制中会影响蛋白糖基化的变量汇总。
见表1。
本文重点对细胞系、培养模式、生产工艺、细胞培养基这几方面对糖基化蛋白药物的糖基化影响研究进行总结。
1. 1 细胞系 在设计新的蛋白质疗法中, 了解一个细胞系可以影响糖基化水平十分关键。
蛋白水解物制备工艺及其在生物技术领域中的应用研究进展
蛋白水解物制备工艺及其在生物技术领域中的应用研究进展张邵博;靳冬武;李明生【摘要】蛋白水解物是蛋白质经酶、酸、碱和发酵等方法水解得到的混合物,由于其含有丰富的氨基酸和多肽,并为细胞生长提供多种营养成分、贴壁因子及生长因子类似物等,从而在生物技术领域中得到了广泛的应用.本文综述了蛋白水解物制备工艺、在生物技术领域中的应用及其在细胞培养中对细胞增殖、代谢的影响,以期为蛋白水解物的开发和应用提供参考.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2019(031)002【总页数】9页(P354-362)【关键词】蛋白水解物;制备工艺;生物领域;细胞培养;应用【作者】张邵博;靳冬武;李明生【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院;甘肃省动物细胞工程技术研究中心;兰州民海生物工程有限公司,兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院;甘肃省动物细胞工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q816;R915蛋白水解物是蛋白质经酶、酸、碱和发酵等方法水解得到的混合物，其主要成分为肽类，还包含少量氨基酸、糖类、脂类、矿物质和维生素等物质[1]。
蛋白水解物的水解效果通常用水解度来评价，但根据其用途评价指标也有所不同，在无血清培养基中主要以氨基酸含量，肽键数为指标，在ACE抑制肽中主要以ACE酶的抑制率为指标，蛋白水解物的抗氧化活性主要以其抗氧化肽含量为评价指标[2]，脑蛋白水解物注射液以各游离氨基酸和总游离氨基酸的含量为评价指标[3]等。
图1为蛋白质水解为多肽或氨基酸的结构图。
图1 蛋白质水解结构图Fig.1 The structure pattern of protein hydrolysis process1880年Nagelli等[4]人最先将蛋白水解物用在生物技术领域，即微生物培养。
1900年蛋白水解物成为Vogoes-Proskauer 和McConkey培养基中的重要成分[5]。
在1914年Difco实验室将蛋白胨用在细菌培养基中[5]。
动物细胞培养技术
细胞生物学在生物制药方面的应用及实例—————动物细胞培养技术【摘要】现代生物制药产业中有着众多核心技术，其中哺乳动物细胞培养技术作为生物制药产业的下游通用性核心技术之一，发挥着重要作用。
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962 年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。
【关键词】生物制药动物细胞技术发展历史应用前景动物细胞技术用于生物制药的历史早期疫苗产业: 往往利用动物来生产疫苗，譬如用奶牛来生产天花疫苗。
天花是继瘟疫之后世界上传播最广、最可怕的疾病。
1555年，墨西哥天花大流行，全国1500万人口中，死了200万人。
16-18世纪，欧洲每年死于天花病的人数为50万，亚洲达80万人。
有人估计，18世纪内有1.5亿人死于天花。
18世纪后期，一位英国乡村医生E. Jenner发现，一种挤奶女工容易得的、比较温和的疾病的人，对天花也有免疫力。
在1798年发表自己的发现 .到1975年，天花全世界范围内初步消灭了。
1920～1950，开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗等。
1950 ～ 1985期间，细胞工程及其他技术的进步，利用细胞培养技术，生产多种人用疫苗：预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等，并用于生产多种兽用疫苗。
用类似的细胞培养技术还可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品。
而先决条件是能够获得可分泌目的蛋白的细胞系。
但这在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，成本高。
动物细胞大规模培养技术的发展历史1962年凯普斯提克等人实现了BHK21细胞的悬浮培养，这是动物细胞工业化应用的突破性进展，其连同传代细胞系的建立，共同驱动了细胞大规模工业生产进程的发展。
1967年，维茨尔开发了微载体并进而实现了贴壁细胞在生物反应器中的大规模培养。
动物细胞培养技术的应用和最新进展
动物细胞培养技术的应用和最新进展动物细胞培养技术是一种以哺乳动物细胞为材料通过体外培养方式生产蛋白质、疫苗、抗体等生物制品的技术。
自20世纪50年代发展至今，动物细胞培养技术已成为生物制药领域不可或缺的一环。
动物细胞培养技术的应用范围广泛。
在生物制药领域，动物细胞培养技术被广泛应用于生产重要的生物制品，如免疫球蛋白、疫苗、生长激素等。
在医学研究领域，动物细胞培养技术是模拟人体疾病发生、发展的重要工具。
同时，动物细胞培养技术还被广泛应用于毒理学、环境保护、食品科学、农业科学等领域。
动物细胞培养技术的最新进展主要体现在以下三个方面。
一、三维培养技术传统的动物细胞培养技术主要是在二维的平面培养基上进行，但这种方法不能完全模拟人体内三维环境。
近年来，三维培养技术呈上升趋势。
三维培养技术可以更好地模拟生物组织的真实环境，有利于研究体内疾病的发生机理及药物研发。
例如，三维培养技术已被应用于肿瘤细胞的筛选，在肿瘤研究中发挥了重要作用。
二、基因编辑技术动物细胞培养技术中的基因编辑技术是目前最热门的研究领域之一。
借助基因编辑技术，可以更好地研究细胞的功能及相关基因对生命活动的调节。
例如，通过基因编辑技术，可以对病毒基因进行编辑，用于研究病毒的传播机制及遗传规律。
此外，基因编辑技术在遗传病治疗方面也具有广阔的应用前景。
三、人工智能技术在动物细胞培养技术中，人工智能技术的应用也开始增多。
借助人工智能技术，可以更好地对大规模生物数据进行处理和分析。
例如，预测药物对蛋白质结构的影响及酶的特异性。
同时，人工智能技术还可以为动物细胞培养过程中的质量控制提供支持。
总的来说，动物细胞培养技术作为生物制药领域不可或缺的一环，其应用前景十分广阔。
随着科学技术和生产工艺的不断进步，动物细胞培养技术必将在世界范围内得到更广泛的应用。
哺乳动物细胞高效表达系统研究进展
第34卷总第89期2013年3月西北民族大学学报(自然科学版)J ournal of N or t hw es t U ni ve r si t y f or N at i o nal i t i es(N at ur al Sci enc e)V oI．34．N o．1M ar ch，2013哺乳动物细胞高效表达系统研究进展柏家林1，2(1．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)[摘要]哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节，而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分．文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展．同时。
为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求，对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍．[关键词]哺乳动物细胞；高效表达载体；细胞代谢工程；生物工程制药[中图分类号】Q811．4[文献标识码]A[文章编号]1009—2102{2013)01—0043—09利用哺乳动物表达系统生产药用蛋白是21世纪生物制药工业的主要发展方向．用于制备基因工程药用蛋白的表达系统有原核和真核表达系统．原核表达系统主要是大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度发酵生产、成本低等优点，成为表达产物不需要修饰的小分子蛋白类药物的首选表达系统．而对于糖蛋白和全抗体类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成分泌、生物活性、药代动力学行为、体内稳定性以及免疫原性等特性．由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等进行糖基化的细胞器，所表达的产物是非糖基化的，且常以包涵体的形式存在．而酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞又不一样，表达产物寡糖链末端多为甘露糖(m ar i nose，M an)、N一羟乙酰神经氨酸(N—gl ycol yneur am i ni c aci d，G l cN A c)和半乳糖(gal act os e，G al)，它们均容易被肝细胞、巨噬细胞表面的受体识别而清除…．特别是G l cN A c寡糖链，除在人的胚胎期体内存在外，成人一般都不表达，因此对人可能有免疫原性．目的基因在哺乳动物细胞中的表达产物不但能正确组装成多亚基蛋白，而且与天然蛋白的结构、糖基化的类型和方式几乎一致．常用于药用蛋白生产的哺乳动物细胞有3T3、C H O、B H K、H e l a和H epG2，约70％药用蛋白用C H O细胞生产【2J，而且C H O细胞能在10000L以上生物反应器中高密度、无血清悬浮培养【3,4J．经过近30年的努力，已有报遭单个细胞每天表达蛋白量达20Pg的工程细胞株【5】，分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2000万细胞／m L 以上，蛋白产量高达10g／L[3,6,7】．但与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平仍较低、获得高表达工程细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高．因此，建立哺乳动物细胞高效表达体系包括高表达载体构建、高表达工程细胞株的获得、生物反应器无[收稿日期】2012—12—20【基金项目]中央高校基本科研业务费专项资金项目(zyz2011074)，校企合作项目(h2011—19)．[作者简介]柏家林(1966一)，男，甘肃天水人，理学博士，博士后，教授，主要从事功能基因组学、动物分子育种及生物技术相关面的研究．一43—血清高密度培养工艺以及目标蛋白的分离纯化工艺，是生物制药工业研究和生产的关键技术．本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞改造的研究进展作一介绍．1哺乳动物细胞高效表达载体的构建目的基因在哺乳动物细胞中的表达受目的基因所整合染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响．构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化、转录与翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑．1．1整合位点的优化目的基因在C H O细胞染色体上整合位点的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性作用．只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因．因此，保证将表达载体整合在C H O细胞染色体上转录活跃位点的细胞克隆挑选出来是提高C H O细胞表达水平的关键步骤之一．1．1．1利用选择基因的弱化表达提高转基因表达水平选择基因(如neo、dhf r)的弱化表达，可使大量整合在低表达位点的细胞由于选择标记基因表达量不足而在选择培养基条件下中毒死亡，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达足够的选择基因产物而存活下来形成克隆．通过在转录水平、翻译水平和构建活性降低的选择基因突变体可实现选择基因的弱化，如将选择基因置于缺失增强子的SV40启动子控制下或内含子中、改变K ozak序列、在选择基因起始密码子A TG前加不同读框的A T G等．B r i an将(1996)选择基因dhf r置于目的基因前一个人工内含子中构建了双顺反子表达载体C M V—D I—t PA，通过筛选表达dhf r基因的克隆，将目的基因的表达量提高了11倍【8]．W em er等(1998)在neO的内部插入一个人工内含子，使用这种载体筛选到的阳性克隆经基因扩增后C D20单克隆抗体的表达量高达2r ag／m L[91．1．1．2利用核基质附着区提高转基因表达水平在载体上添加染色体上的某些特定序列如核骨架附着区(scaf f ol d a t t ac hm e nt r egi on，SA R s)或核基质附着区(m at r i x at t achm ent r egi on，M A Rs)，可使表达载体整合到宿主细胞染色体后能模拟染色体的高转录活跃区，从而使形成的阳性克隆较均一地高效表达目的基因．K odur i(2001)用反义遗传学方法克隆了表达载体在高表达C H O细胞株染色体上整合位点两侧的侧翼序列H I R PE(hot sp ot f or i nc r eased r ecom bi nant pr ot ei n expr essi on)，发现这些序列富含转录活跃区的类A l u序列、基质附着区等元件．他们用H I R PE构建了pTV l载体，使C TLA4～I g在C H O细胞中的基础表达水平提高了10倍【10|．E m er y (1998)用由p一球蛋白基因的位点控制区(10ci cont r ol r egi on，LC R)的超敏感位点(hyper s ens i t i ve s it es)第2、3和4的核心元件构成了一段序列，它能使鼠红白血病细胞(m ur i ne er yt hr ol e ukem i a，M E L)的克隆形成率提高94倍，且能明显提高a一球蛋白的表达量【11]．K i m等(2004)用人J3一球蛋白基因M A R s 构建的载体转染细胞后的表达水平比对照组提高了7倍，并且在每次用叶酸类似物氨甲喋呤(am et hopt er i n，M T X)加压后不用挑选单克隆，大大缩短了获得高表达细胞株的周期[12|．1．1．3利用位点特异性重组提高目的基因表达水平一种方法是通过位点特异性重组将目的基因整合到细胞基因组中的转录活跃区，即先将含有定点重组位点的选择标记基因整合到染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系，在重组酶介导下，表达载体通过位点特异性重组定点整合在染色体高表达区，如C r e—k】(P和Fl p—Fr t位点特异性重组系统．K i t o等用带有dhf r扩增基因及融合了Lo】【P 位点的绿色荧光蛋白融合基因的质粒转染C H O—dhf r一细胞株，经过筛选并用M TX加压扩增后得到了可进行基因扩增的定点整合C H O细胞系【131．I nvi t r ogen公司则用Fl p—Fr t位点特异性重组系统建成了多种商品化的定点整合系统，包括293细胞、B H K细胞和正常C H O细胞．但这些细胞的整合位点没有经过系统的优化筛选，而且不能很好地与常用的加压系统(如M TX加压扩增系统等)配合，定点整合一44—的外源基因的表达水平通常都较低．刘志刚等(2004)借助于位点特异性重组和高效筛选，实现了FRT 位点在C H O—dhf r一细胞基因组中转录活跃区的整合，单链抗体一尿激酶融合基因表达量达5t,g／(106细胞24h)¨4|．另一种方法是利用体细胞同源重组即基因打靶技术，实现目的基因定点整合在宿主细胞染色体转录活跃区，但由于体细胞基因打靶比较困难，目前只有少量成功报道【l0I．目前关于真核细胞在染色体水平上调控基因表达的机制还不完全明了，染色体高转录活跃区的鉴定及分离费时费力而且不能保证所获得的就是转录的最活跃区．相比较而言，通过选择基因的弱化，利用位置效应来提高转录效率从而达到目的基因的高表达是一种更为有效的方法．1．2增加目的基因拷贝数单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的．因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的C H O工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的重要环节．目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，如二氢叶酸还原酶(dhfr)和／或谷氨酰胺合成酶(G S)是常用的扩增基因[15，16]．C H O—dhf r扩增系统常采用dhf r基因缺陷的细胞株(C H0一dhf r一)，可使目的基因的拷贝数扩增至1000余倍．W em er 等(1998)在nEo基因的内部人工内含子中放置目的基因和dhf r基因偶连的表达单元，通过用M TX对阳性克隆dhf r扩增，C D20单克隆抗体的表达量高达2g／L[9|．与dhf r扩增基因相比，G s扩增基因是一种显性基因扩增选择标志，应用G S基因扩增系统常只需l～2轮蛋氨酸黄酰胺(m et hi oni ne sul phoxi m i ne，M SX)加压筛选即可获得高表达细胞株，扩增效率较高，并且在含有G S基因的细胞株中也可得到有效的基因扩增．在C H O细胞中，G S经1轮扩增，基质金属蛋白酶组织抑制因子(t i s sue i nhi bi t o r of m et al l opr ot ei nas es，TI M P)的表达量能从每106细胞9弘g／d提高至110扯g／dt22|．B ebbi ngt on 等用1株以G S作为扩增基因的鼠骨髓瘤细胞(N So)表达人一鼠嵌合抗体，经l轮扩增后，其表达水平为每106细胞10～15gg／d[17I．1．3转录水平在目的基因拷贝数一定、整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要．启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及m R N A的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素．因此人们希望通过寻找转录起始效率高、适用范围广的启动子、增强子来提高目的基因转录水平的表达效率．目前常用病毒源性和细胞源性的强启动子，如m C M V、hC M V、hE Fl a、人C—f os、鸡胞浆8一肌动蛋白等启动子．Bi等发现在含有人C—l os启动子和绿色荧光蛋白(G FP)的报告基因系统中，C —f os启动子控制下G F P的平均表达量比C M V启动子下的更高[18]．研究表明C M V启动子在细胞处于S期、细胞生长迅速时，转录活性最高．但在大规模生产的中、后期，多数细胞生长不旺盛时，可显著影响外源基因的表达水平．与之相比，hE Fl a启动子的转录起始效率更强，并且其转录活性不受细胞周期影响，更适合大规模生产重组蛋白．除寻找强启动子、强增强子之外，用含有不同启动子、增强子的组成元件构建转录效率更高的杂合启动子或杂合增强子也不失为提高转录效率的一个好方法．M a sayuki 等(1997)发现C M V增强子能提高hEF—l a启动子控制下目的基因表达量4～9倍[19]．K i m等发现将hE Fl a启动子的第1个内含子置于m C M V启动子与荧光素酶之间能极大地提高目的基因在C H O细胞中的表达，使荧光素酶的表达量提高了8．2倍【20I．xu等(2001)对CM V和B一肌动蛋白的启动子和增强子、内含子及SV40、B G H和m R B G的pol y(A)等不同转录调控元件的多种组合在H eL a、H epG2和E C V304细胞中进行了系统比较后发现，m R B G的pol y(A)比SV40和B G H的pol y(A)的适用范围更广，能更有效地提高目的基因的表达【21J．在转录过程中，转录因子通过D N A结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达．因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达．C ocket t(1990)将反式作用于C M V启动子的腺病毒E I A蛋白基因整合到C H O细胞中，通过提高C H O细胞E I A的表达水平，使C M V启动子控制下的一45—TI M P基因表达水平提高了10倍[22|．另有研究表明，EG F和H RG一91(H e r egul i n be t a1)能提高E FI a m R N A的转录量和蛋白质的表达[23|．R eza等(2002)将用作结合D N A的锌指结构和V Pt6蛋白的转录激活结构域融合构建了人工转录激活因子．通过表达人工转录激活因子，将C M V启动子的转录效率提高了2倍多[24|．随着真核细胞在转录水平调控机制的进一步研究，杂合或人工启动子以及人工转录激活因子的构建将是更为有效的提高转录效率的方法．1．4翻译水平除了转录水平的调控外，翻译水平的调控(如m R N A寿命、m R N A的翻译起始效率)和翻译产物加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要影响．pol y(A)的存在不但能影响m R N A稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高m R N A翻译水平．内部核糖体进入位点(i nt er nal r i bosom e ent r y si t e，I R E S)能使同一m R N A中除第1个基因之外的其他基因得到有效表达．翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率．Jacks on首先从细小R N A病毒中发现了I R ES．I R ES下游的开放阅读框采取不依赖帽子结构的方式，直接起始翻译．同时，I RES有效介导的内部起始翻译要求起始密码子处有一个有利的翻译环境，当第一个A U G周围序列不利于翻译起始时，I R ES可增强下游A U G的翻译起始[25]．如在V EG F的5’端非翻译区包含1个有功能的I R ES，当eI F4复合物成为限制因素时，I R ES介导的内部起始翻译与其他m R N A竞争时存在优势，它能在依赖帽子结构翻译受损时提供一种有翻译能力的m R N A[26]．此后，Paul ous等(2003)依据IRE S的初级序列和二级结构的保守性以及在离体情况下它们对内部起始翻译要求的条件，将小核糖核酸病毒的IRES分为3类：肠遭病毒(ent erovi r us)和鼻病毒(rhi novi rus)的I R ES，它们在兔网状细胞裂解液(r abbi t r et i cul ar ce l l l ysa t e，R R L)中缺乏特殊的细胞蛋白时不能有效起始翻译；脑心肌炎病毒(EM C V)和口蹄疫病毒(FM D V)的I R ES在不补充R R L时也能有效起始翻译．盐浓度的波动和2A或LB蛋白酶介导的el F4G切割对这类IR ES介导的起始翻译的影响不显著．甲肝病毒的I RE S，它在RR L中高度有效，但在R RL中添加细胞的粗提物时不能刺激它，在eI F4G受2A 或L B蛋白酶切割时受抑制[271．由于第2类IR ES具有对细胞微环境的广泛适应性和内部起始翻译效率高的特点，它已经广泛应用于双顺反子或多顺反子的哺乳动物细胞表达载体的构建．K auf m an等(1991)通过在双顺反子内加入EM C V的内部核糖体进入位点实现了提高目的基因在双顺反子表达载体中的表达效率‘28f．翻译增强子是具有与IR ES不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件．St ei n等(1998)发现在组织缺氧情况下，V E G F m R N A寿命大为提高，V EG F翻译增强的程度可高达40倍，由此发现了具有翻译增强子和IR ES双重功能的V EG F163片断[26]．C hr i st i an在纤维细胞原生长因子2 (F G F一2)的3’端非翻译区发现了2个能使C A T的翻译效率提高9倍的独立元件TE l和TE2,它们之间具有累积效应，能与FG F一2m RN A的5’端非翻译区协同作用，增强翻译效率达12倍[29]．V i vi nus (2001)在H sp70m R N A的5’端非翻译区发现了一个能作为m R N A通用翻译增强子的元件．H sp70 m R N A的翻译增强子没有I R ES结构，它在C A T编码区上游能提高C A T的表达效率10倍，并且能在依赖于帽子结构的翻译过程中起到增强翻译效率的作用【30】．用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因密码进行优化是另一种提高翻译效率的方法．K i m等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人EPO基因，再以酵母偏爱的密码子编码人E PO基因作对照来比较优化，结果人优化E PO基因密码子比非优化人E PO基因密码子的表达效率高2～3倍[31]．2宿主细胞的改造随着对细胞代谢途径和调控机理的深入了解，越来越多的研究集中在对细胞本身进行改造的代谢工程来达到优化细胞生长状态，提高产品产量和质量，延长生产周期的目的．目前哺乳动物细胞的代谢工程包括抗凋亡工程、细胞周期调控工程、糖基化工程、细胞增殖控制技术和多基因代谢工程等．2．1抗凋亡工程——46——细胞在大规模培养初期，目的蛋白的表达与细胞的增殖速率呈正相关．但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐凋亡(apopt osi s)，重组蛋白表达量逐渐降低．细胞凋亡是一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡，生物反应器中大多数细胞的死亡都是因细胞凋亡引起的．为防止细胞培养过程中的细胞凋亡，一般可采用如下三种重要措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏．②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程．③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞．由于细胞凋亡是由一系列蛋白质控制的过程[32I，因此在目的细胞中引入某些特定基因有可能抑制细胞凋亡的发生．抗细胞凋亡的原癌基因bc l一2(B淋巴瘤／自血病蛋白一2)是被研究得最多的细胞凋亡基因，它在细胞凋亡级联反应中处于重要环节．通过遗传工程使哺乳动物细胞表达抗凋亡基因bc l一2，在大多数情况下虽不能防止细胞死亡，但能延长细胞寿命，增加产物产量【33|．Si m ps on等(1997)将bcl 一2稳定转染TB／C3细胞后，细胞活力增强，抗体滴度上升【341．I t oh等(1995)也同样发现转染了bc卜2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍【351．bc l一2家族中的另外一些成员可能也有与bcl一2一样甚至更强的抑制细胞凋亡的作用．如bc l—X L在许多哺乳动物细胞中得到表达后，可对有些诱导因素如营养物缺乏、辐射和糖皮质激素等引起的细胞凋亡有抑制作用[36,37】．另外有实验表明，当共表达bag一1和bcl-2基因时，可产生有相同或协同抗细胞凋亡作用[38|．L e e等(1996)在提高bcl-2表达水平的同时降低凋亡的最终执行者C as pase一3的表达水平，能明显提高细胞的抗凋亡能力[39I．近年来，人们将抗凋亡基因bc卜2应用于动物细胞培养做了大量工作[40|．另外，对bcl—X L或bcl—2的突变体研究表明，抗凋亡基因的出现可对抗营养及血清限制、有毒物质和代谢废物积累、氧消耗、流体力学应激等引起的凋亡，提高细胞活性，延长培养周期，增加最终细胞密度和产物浓度．Fi guer oa等(2004)在C H O细胞内同时表达抗凋亡基因aven和bcl一2家族成员bcl—X L，同时表达比单独表达ave n或bcl—X L具有更强的抗凋亡能力，在无血清培养基中的各重组细胞的活力分别为85％，50％和30％[41]．另外，采用反义技术将前凋亡基因c—j H n转染细胞也可获得具有抗凋亡以及增殖受控的细胞系，亦是抗凋亡的一种策略【42|．2．2细胞周期调控工程理想的生产过程必需同时维持细胞活性状态以及产物蛋白的表达，即首先使细胞快速增殖到高密度，在细胞凋亡发生之前，控制细胞增殖速率并诱导其进入一个增殖静止期，即产物形成期，此时细胞将获得的代谢能量从用于细胞增殖转为用于产物分泌，细胞维持在活性相对较低的存活状态．通过控制细胞增殖速率，产物分泌量得以大大提高．随着对细胞周期调节机制研究的深入，研究人员已将细胞周期调控基因应用于规模化培养的细胞增殖控制．Fuss enegger等(1998)在C H O细胞中分别表达了p21、p27和肿瘤抑制基因p53三种细胞周期G1／S抑制蛋白，通过抑制cycl i n—E—C D K2复合物的磷酸化活性，阻止细胞进入s期．其中，p21基因转染后细胞获得了生长抑制．其生长静止可持续几周之久，报告蛋白分泌碱性磷酸酶(secr et ed al kal i ne phospha t ase，SE A P)的单位产量增加10--15倍；p27转染后的细胞生长静止但并不发生凋亡，产物表达量增加15倍．由三种蛋白组成的三顺反子元件转染C H O后，SE A P产量比对照提高30倍[433．2．3糖基化工程蛋白质有两种糖基化方式：N一糖基化和O～糖基化．一般来说，0一糖链对蛋白质的特性影响不大，而N一糖链的不同对产品可产生较大影响．N一糖链通常都有一个五糖核心，即M a n al一6(M an Q1)一3(M an81)--，4G1cN A c81-，4G1cN A c．根据外层链的不同，可分为：高甘露糖型、杂合型与复合型[55]．三种因素决定糖链类型不同：①合成肽链的不同．②细胞内糖基化酶的不同．③细胞培养环境的影响．用C H O细胞表达的糖蛋白，其类型与人的尽管近似，但也不尽完全相同．C H O细胞缺少Q一2，6～唾液酸转移酶的功能，因此缺少唾液酸化的糖基．为此，一面人们正尽量寻找能用以生产糖蛋白类药一47—物的人类细胞，如用N a m al w a细胞表达t—pA[44l、pr o—U K[45]和EP O[46|，它们的糖基化和人的自然产品一致．另一方面，人们正打算采用“糖基化工程”(gl ycos yl at i on engi neer i ng)，即应用基因工程手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的．如在t—PA基因中进行点突变，改变了一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，使t—PA在血浆中的清除率比原来减少了10多倍【471．又如M i neh等(1995)将t—PA与Q一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O 细胞，结果表达的t—PA的糖基化情况与人类的更接近【48】．Lam ot t e等(1999)将丫一干扰素基因与a一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O细胞，结果了一干扰素中a一2，6一唾液酸化程度比对照提高了68％(不加丁酸钠)和82％(加丁酸钠)．此外，控制和改变细胞的培养环境对N一糖基化也可产生一定影响【491．H os oi等(1996)研究表明，通过添加地塞米松、改变培养基糖的成分、使培养温度突然下降等，都可使pr o—U K的糖基化形式从含岩藻糖的2分枝复杂型寡糖链，转变为含岩藻糖的3或4分枝复杂型寡糖链，从而使生产的重组蛋白质糖基化形式与人类的一致[s0]．2．4多基因调控代谢工程由于细胞内部调控网络在空间和时间上的复杂性，一个性状并不完全由某一个基因控制．最新的代谢工程策略提出在细胞内进行可分别调控表达的多个基因，以期形成一个模拟细胞调控网络的人造调控系统，最简单的是双调控表达技术．Cor nel i a等(2001)通过链阳菌素和四环素双诱导表达体系构建了重组C H O细胞株，能分别表达p27基因和它的反义链．当诱导p27基因表达时实现了细胞生长的停滞，处于G l期细胞增加了40％，而表达p27基因的反义链，则使细胞内自身p27蛋白表达下降，使细胞增殖的速度提高了一倍，促进了细胞的生长[51,52】．2．5细胞增殖控制工程工业化大规模细胞培养中，常采用无血清／无蛋白培养基(Ser um f ree m edi um，SFM／Pr ot ei n f r ee m e di um，PFM)来降低细胞培养和产品纯化的成本．但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、粘附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中常表现出细胞活力降低、贴壁性差等现象，细胞增殖能力下降，进而导致分泌目的蛋白的能力下降．在培养基中添加胰岛素和成纤维细胞生长因子可使细胞恢复增殖能力，同时，细胞内的细胞周期调控因子C ycl i n—E的表达也增加．C ycl i n—E能使细胞周期的G1期延长，s期缩短，提示人们可通过表达C ye l i n—E的方法来增加细胞的增殖能力．人们还通过将生长刺激因子、粘附因子基因导入C H O细胞中，让C H O细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在S FM／P FM中良好生长．G andor等(1999)将介导C H O细胞在SF M中贴壁和扩展的玻表粘连蛋白(vi t r onec t i n)基因置于M M T V启动子控制下导入Cl I O细胞，使其获得了在PFM中j!占壁生长和扩展的能力[53]．另外，同时表达胰岛素样生长因子(I G F一1)和转铁蛋白(t r ansf er r i n)的所谓“超级C H O细胞”在PFM上也能生长良好【54J．随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、扩展因子、抗凋亡因子、转录与翻译的反式作用因子以及其他细胞生长存活所必需成分的基因和顺式表达调控元件转入宿主细胞，以提高其表达．与此同时把不利于目的基因表达的基因从宿主细胞中敲除或下调其在宿主细胞中的表达，从而把细胞改造为能在SFM／PFM中培养、培养前期细胞增殖快、当细胞密度达到理想值时细胞长时间不增殖、抗凋亡能力强、高表达目的基因的宿主细胞，最终大幅度降低哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本．参考文献：[1]涂宣林，宋后燕．寡糖链的研究进展【J]．药物生物技术，1998，5：55—59．[2]Ja yapal K P，W l as ehi n K F，H u W S，Y a p H G S．R ec om bi nant prot ei n t he rape ut i c s f r om C H O c el l s一20yea r s and cou nt i ng [J J．C he m Eng Pi ng，2007，103：40—47．[3]Li F，N at araj an V，Shen A，R o ber t K，A m anuU ah A．C e i l cul t ur e proc es se s f or m onocl onal ant i bo dy pr oduct i on[J]．Lande-———48．．——。
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哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
在目前制药领域，利用哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物取得了积极进展，哺乳动物细胞制备的蛋白质药物以其具有与天然蛋白质相似的特性而取得了重要应用。
从蛋白质药物制造技术发展来看，考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋白质药物质量较高，并且制备过程难度低、制备成本不高，由此决定了哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物将在未来的制药领域取得全面发展和应用。
基于这一认识，我们应认真总结哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展，并深入探讨哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物技术的发展前景，做好哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研制工作。
标签：哺乳动物细胞；培养制备；充足蛋白质药物；进展分析
1 前言
在近年生物制药发展中，利用哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质已经成为了重要的发展方向。
研究表明，哺乳动物细胞培养制备的蛋白质，无论是在制备质量上，还是在蛋白质含量上，都达到了药用标准，并且在性能上也与天然蛋白质较为接近。
基于这一优势和特点，关于哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物的研究得到了有效开展，并取得了积极的研究效果。
结合目前关于哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的现状，该研究在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中取得了积极进展。
2 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得的进展
COS细胞曾是进行外源基因表达研究中用途最广的宿主，但由于其严重的贴壁作用，限制了大规模悬浮培养的实际应用。
目前哺乳动物细胞生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。
CHO是目前生物工程上广泛使用的细胞。
该细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是表达复杂生物大分子的理想宿主。
工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞及CHO/dhfr-细胞，被广泛地用于重组DNA蛋白的稳定表达生产。
HEK293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，它易于转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
利用瞬时基因表达方法，采用悬浮培養系统，可以快速、方便地获得mg级蛋白。
目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培养生产的研发中，如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株（MDCK）、红系细胞株、以及人的胚胎干细胞等。
由于不同重组细胞系表达的重组蛋白其稳定性和糖基化类型不同，需要根据目的蛋白选择最佳的重组细胞系。
从上述研究成果来看，哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得了积极进展，其产生的影响主要表现在两个方面：一.哺乳动物细胞系的分类越来越清晰，主要分为CHO和HEK293两大类细胞。
二.哺乳动物细胞系在培养
生产中种类得到了拓展，对推动哺乳动物细胞系研究具有重要作用，满足了哺乳动物细胞系研究需要。
3 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组表达载体中取得的进展
外源基因可以通过病毒载体感染或质粒载体转染等方式进入宿主细胞。
病毒载体是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等，近几年杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达也越加受到重视。
质粒载体与病毒载体不同，它是借助于物理或化学的作用导入到细胞内。
人工构建的哺乳动物细胞质粒表达载体一般为穿梭载体。
含有原核基因序列，便于载体在原核细胞中扩增和大量制备，另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列等。
Invitrogen 公司的pcDNA系列载体是实验中常用的哺乳动物细胞表达载体。
外源基因能否在宿主细胞中获得高效表达主要取决于表达载体上启动子和增强子的强弱、二者之间的搭配、以及它们与宿主细胞类型的兼容性。
目前常用表达载体的启动子包括人巨细胞病毒早期启动子（CMV-IE）、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列。
近年来新发现的强启动子如人编在蛋白（ubiquitin）C基因启动子以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高的活性，而且具有更广阔的宿主细胞范围。
上述研究表明，不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化表达载体、提高蛋白质药物在哺乳动物细胞中表达量的不变的方向。
4 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在生物制备过程中取得的进展
哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在生物反应器中进行的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达20吨。
为了节约成本，减少动物血清对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如UltraCulture，ProCHO，Pro293等。
考虑到制药过程的现实需要，提高生物制备能力是保证蛋白质药物制备取得实效的关键。
从目前的研究过程来看，提高生物制备能力的研究成果主要表现在以下几个方面：
4.1 培养方式可以为单细胞悬浮式培养。
这样可以减少培养基，提高培养效果，降低培养过程成本。
4.2 反应罐的体积可以达到20吨以上。
现有的培养实验将反应罐的体积设定在20吨，并取得了良好的培养效果。
因此在蛋白质制备过程中，可以根据实际需要扩大反应罐的体积，满足蛋白质制备需要。
4.3 培养中使用无血清培养基。
既降低培养基成本，又减少了血清中动物成分的污染可能。
5 结束语
通过本文的分析可知，结合生物制药的研究与发展形势，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能，从目前的研究来看，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得了积极进展，在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突破。
为此，我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研究，为生物制药发展提供有力支持。
参考文献
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